口蹄疫免疫抗體檢測(cè)經(jīng)典方法詳述

液相阻斷ELISA實(shí)驗(yàn)原理液相阻斷ELISA實(shí)驗(yàn)原理是抗原抗體在液相中反應(yīng)，病毒抗原與稀釋好的被檢血清首先在液相中反應(yīng)，然后抗原抗體復(fù)合物和沒(méi)有完全被血清抗體阻斷的病毒抗原被轉(zhuǎn)移到包被了口蹄疫特異性抗體的ELISA板中，沒(méi)有完全被血清抗體阻斷的病毒抗原被ELISA板中的抗體捕獲，再通過(guò)酶結(jié)合物與底物顯色10～15min，最后加入終止液進(jìn)行讀數(shù)?？贵w滴度以阻斷50%病毒抗原的血清稀釋度表示。液相阻斷ELISA特點(diǎn)1、優(yōu)勢(shì)口蹄疫抗體液相阻斷ELISA檢測(cè)方法專為檢測(cè)FMD全病毒抗體設(shè)計(jì)，是針對(duì)完整病毒粒子的抗原位點(diǎn)進(jìn)行抗體定性定量檢測(cè)，通過(guò)對(duì)被檢血清的倍比稀釋，定量測(cè)定血清中抗體含量的高低。液相阻斷ELISA與中和試驗(yàn)的原理相似，又被稱為體外病毒中和試驗(yàn)，克服了病毒中和試驗(yàn)無(wú)法在臨床檢測(cè)中推廣應(yīng)用的缺點(diǎn)，適用于大批量樣品的血清學(xué)調(diào)查。同時(shí)，口蹄疫液相阻斷ELISA抗體檢測(cè)技術(shù)具有良好的敏感性、可重復(fù)性，與攻毒保護(hù)有很好的相關(guān)性，現(xiàn)被廣泛應(yīng)用于口蹄疫免疫抗體水平的監(jiān)測(cè)。2、劣勢(shì)液相阻斷ELISA操作步驟較多，耗時(shí)較長(zhǎng)，對(duì)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)人員技術(shù)性、熟練性和操作性要求較高。液相阻斷ELISA的操作細(xì)節(jié)及注意事項(xiàng)1、樣品的保存及使用全血樣品采集后應(yīng)盡快分離血清避免溶血，500～4000rpm離心5～10min；若無(wú)離心條件，可將全血樣品在室溫下(20℃)傾斜放置2~4小時(shí)(依室溫而定)，或4~8℃環(huán)境中過(guò)夜待其自然凝固，然后轉(zhuǎn)移上清液于新管待測(cè)。血清0～4℃條件下可保存5d，如采用－15～－20℃冷凍保存時(shí)間更長(zhǎng)。冷凍保存血清樣品需在4～8℃條件下解凍，再平衡至室溫，稀釋前需充分混勻。2、試劑的回溫及孵育（1）試劑回溫試劑盒中的試劑，包括包被用的反應(yīng)板，在使用前應(yīng)恢復(fù)至室溫，將其提前拿出放置1～2h平衡至室溫（20～25℃），冬季可置于25℃左右的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)回溫。（2）加樣孵育每次加樣后反應(yīng)板必須用封板膜封嚴(yán)，否則會(huì)造成水分過(guò)多蒸發(fā)，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果；反應(yīng)板盡量均勻放置于孵育箱，不可重疊放置，以免傳熱不均勻。在孵育時(shí)，實(shí)驗(yàn)操作者一般習(xí)慣將ELISA板放入溫箱即開(kāi)始計(jì)時(shí)，沒(méi)有考慮ELISA板孔內(nèi)溫度升至37℃尚需一定的時(shí)間，這樣容易造成實(shí)際測(cè)定中溫育時(shí)間不夠，因此實(shí)驗(yàn)時(shí)需根據(jù)具體室溫情況可適當(dāng)增加ELISA板在溫箱中的孵育時(shí)間。3、不同批次試劑盒的使用不同批次試劑盒中的每種試劑成分都被優(yōu)化和作為一個(gè)整體工作，為了使實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確，避免使用不同批次的試劑成分，尤其是病毒抗原，不同批病毒抗原的工作濃度不同，因此不能隨意亂用，要對(duì)應(yīng)于相同批次試劑盒中的各種成分使用，同時(shí)要避免反復(fù)凍融病毒抗原，可將其先進(jìn)行小體積封裝-20℃保存（-40℃保存效果更好），每次實(shí)驗(yàn)時(shí)按需取封裝抗原。4、試劑的配制配制試劑前后都要充分混勻，濃縮的PBST液在低溫下會(huì)有無(wú)機(jī)鹽結(jié)晶析出，使用前可水浴或恒溫培養(yǎng)箱融化，用無(wú)離子水或超純水做25倍稀釋。底物溶液按操作說(shuō)明配制，現(xiàn)配現(xiàn)用。5、血清的稀釋、加樣、轉(zhuǎn)移、洗滌及拍板（1）血清的稀釋：稀釋待檢血清時(shí)先加稀釋液，然后加待檢樣品。（2）加樣：加樣時(shí)要將液體加在孔底，避免加在孔壁上部，同時(shí)輕輕晃動(dòng)均勻，不能出現(xiàn)氣泡，否則一些弱陽(yáng)性的樣品容易出現(xiàn)假陰性；加樣不宜太快，不可濺出；每次加樣都要保持同樣的順序，板數(shù)多者要單獨(dú)計(jì)時(shí)，保證每板反應(yīng)時(shí)間充足。（3）移板：將抗原抗體混合液從反應(yīng)板轉(zhuǎn)移至ELISA板上，目的是將反應(yīng)板中的抗原抗體復(fù)合物和沒(méi)有完全被血清抗體阻斷的病毒抗原轉(zhuǎn)移到包被了口蹄疫O型或A型特異性抗體的ELISA板中，繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)的免疫反應(yīng)及酶促反應(yīng)。轉(zhuǎn)移時(shí)，按順序轉(zhuǎn)移，避免出錯(cuò)，同時(shí)及時(shí)更換槍頭。（4）洗滌：洗滌是ELISA操作中的關(guān)鍵技術(shù)之一，每孔加入洗滌液300ul，洗滌3~5次，同時(shí)每次洗滌的時(shí)間一般為30s。洗板時(shí)需保證酶標(biāo)板平放，將洗滌液注滿各孔，避免漏液、溢液現(xiàn)象。

（5）拍板：拍板時(shí)避免手指接觸板底，同時(shí)應(yīng)注意觀察板孔內(nèi)有無(wú)氣泡附著，如有氣泡，則需在加樣前一一去除。6、試驗(yàn)顯色、終止、讀數(shù)（1）顯色：顯色是ELISA操作中的最后一個(gè)反應(yīng)步驟，是酶催化無(wú)色底物，生成有色產(chǎn)物的過(guò)程。反應(yīng)溫度和時(shí)間是影響顯色的因素。因此，加入底物后的反應(yīng)溫度應(yīng)嚴(yán)格按實(shí)驗(yàn)操作說(shuō)明書執(zhí)行。根據(jù)底物顯色情況，反應(yīng)時(shí)間可適當(dāng)調(diào)整為10～15min。（2）試驗(yàn)終止：終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)結(jié)束后應(yīng)盡快加入終止液。（3）OD值讀數(shù)：讀數(shù)前應(yīng)先將酶標(biāo)儀預(yù)熱半小時(shí)，讀數(shù)時(shí)應(yīng)注意微孔板底部潔凈無(wú)污染，如有水分應(yīng)仔細(xì)擦干，同時(shí)定期清洗酶標(biāo)儀濾光片。不同口蹄疫抗體檢測(cè)試劑盒結(jié)果差異分析

目前除了液相阻斷ELISA試劑盒外，市場(chǎng)在售口蹄疫抗體檢測(cè)試劑盒種類較多，其他大部分試劑盒僅包被結(jié)構(gòu)蛋白VP1的部分片段；若僅包被VP1，導(dǎo)致毒株特異性強(qiáng)，而同一血清型不同譜系毒株VP1序列差異大，所以檢測(cè)結(jié)果常常出現(xiàn)偏頗。而液相阻斷ELISA抗體檢測(cè)試劑盒包被全病毒抗原，對(duì)同一血清型不同譜系毒株差異小，檢測(cè)結(jié)果更客觀、準(zhǔn)確。

總結(jié)

口蹄疫滅活疫苗屬于生物制品，當(dāng)疫苗注入機(jī)體后會(huì)發(fā)生復(fù)雜的反應(yīng)，所以口蹄疫疫苗質(zhì)量評(píng)價(jià)必須要科學(xué)全面，才能綜合判斷疫苗的免疫效力。抗體檢測(cè)是目前評(píng)價(jià)口蹄疫疫苗免疫效果的重