與氮素同化相關酶及測定方法

關于與氮素同化相關酶及測定方法自然界中N素循環(huán)第2頁,共29頁，2024年2月25日，星期天一、植物體內(nèi)氮的含量與分布

含量：占植物干重的0.3～5％。

植物種類：豆科植物>非豆科植物

品種：高產(chǎn)品種>低產(chǎn)品種

器官：種子>葉>根>莖稈第3頁,共29頁，2024年2月25日，星期天二、氮的生理功能氮是蛋白質的重要成分（蛋白質含氮16～18％）2.氮是核酸和核蛋白的成分（核酸中的氮約占植株全氮的7％）3.氮是酶的成分4.氮是葉綠素（葉綠素a:C55H72O5N4Mg)的成分（葉綠體含蛋白質45～60％）第4頁,共29頁，2024年2月25日，星期天5.氮是多種維生素的成分:如維生素B1(C12H17ON3S)、B2(C17H18O6N4)、B6(C6H11O3N)

6.氮是一些植物激素的成分（如IAA、CTK）7.氮也是生物堿的組分（如煙堿、茶堿、可可堿、咖啡堿、膽堿－－卵磷脂(磷脂酰膽堿）氮素通常被稱為生命元素第5頁,共29頁，2024年2月25日，星期天三、植物對氮的吸收(adsorption)與同化

(assimilation)吸收的形態(tài)無機態(tài)：NO3-－N、NH4+－N （主要）有機態(tài)：NH2－N、氨基酸、 核酸等 （少量）

植物從外界環(huán)境獲得N主要是通過3條途徑,通過NO3-還原把無機氮轉化為生命體可用的有機氮,通過固氮菌對N2的固定,直接吸收土壤中的銨或有機氮。

植物的氮源主要是銨鹽和硝酸鹽，占土壤含氮的1%-2%。第6頁,共29頁，2024年2月25日，星期天（一）植物對硝態(tài)氮的吸收與同化1.吸收：旱地作物吸收NO3-－N為主，主動吸收

第7頁,共29頁，2024年2月25日，星期天2.同化(1)NO3-－N的還原作用(nitratereduction)過程：NO3-NO2-NH3

NR：硝酸還原酶(nitratereductase)

NiR：亞硝酸還原酶(nitritereductase)

NR，MoNiR，F(xiàn)e、Mn

根、葉細胞質根、葉綠體

第8頁,共29頁，2024年2月25日，星期天

氨的同化植物吸收銨鹽以后，或當植物所吸收的硝酸鹽被還原成氨后，氨必須立即被同化成氨基酸，否則就會毒害植物。因為氨可能抑制呼吸過程中的電子傳遞系統(tǒng)。氨的同化方式為：進入谷氨酸合成酶循環(huán)。作用酶類：GOGAT:谷氨酸合成酶；存在于葉綠體。GS:谷氨酰胺合成酶；存在于葉綠體和細胞質中。GDH:谷氨酸脫氫酶；存在于線粒體中。第9頁,共29頁，2024年2月25日，星期天過程（1）GDH（谷氨酸脫氫酶）途徑酮戊二酸氨谷氨酸各種新的氨基酸酮酸酰胺氨谷氨酸脫氫酶轉氨基作用第10頁,共29頁，2024年2月25日，星期天（2）GS-GOGAT途徑（谷氨酰胺合成酶－谷氨酸合成酶）是高等植物同化氨的主要途徑第11頁,共29頁，2024年2月25日，星期天谷氨酰胺

合成酶COOH│CHNH2│CH2│CH2│CONH2COOH│CHNH2│CH2│CH2│COOH谷氨酸合成酶2H+，2e—COOH│C=O│CH2│CH2│COOHCOOH│CHNH2│CH2│CH2│COOH谷氨酸脫氫酶NH4+吸收NO3—還原N2固定光呼吸NH3NH3NADH谷氨酰胺谷氨酸谷氨酸圖1

氨的同化途徑的模式ATPNADH鐵氧還蛋白

轉氨基作用含氮化合物第12頁,共29頁，2024年2月25日，星期天反應式：NH3＋谷氨酸＋ATP谷氨酰胺＋ADP＋Pi谷氨酰胺＋α-酮戊二酸＋2e－＋2H＋

2谷氨酸谷氨酸＋17酮酸17種氨基酸

蛋白質

谷氨酰胺合成酶谷氨酸合成酶轉氨酶合成

第13頁,共29頁，2024年2月25日，星期天轉氨基作用（transamination）

（1）定義：是指一種α-氨基酸和α-酮酸在轉氨酶的作用下生成相應的α-酮酸和新的氨基酸的過程。（2）生物體內(nèi)兩種重要的轉氨基作用谷丙轉氨基作用谷草轉氨基作用第14頁,共29頁，2024年2月25日，星期天谷丙轉氨酶（GPT）磷酸吡哆醛++①谷丙轉氨基作用②谷草轉氨基作用+谷草轉氨酶（GOT）磷酸吡哆醛+第15頁,共29頁，2024年2月25日，星期天3.酰胺(amide)的形成及意義形成：NH3＋意義：①貯存氨基； ②解除氨毒； ③參與代謝。

谷氨酸(Glu) 酰胺合成酶 谷氨酰胺(Gln)

天門冬氨酸(Asp)ATP天門冬酰胺(Asn)

銨態(tài)氮配方第16頁,共29頁，2024年2月25日，星期天②非脲酶途徑：直接同化尿素氨甲酰磷酸瓜氨酸精氨酸（二）植物對有機氮的吸收與同化1.尿素urea（酰胺態(tài)氮amidenitrogen）

(1)吸收：根、葉均能直接吸收(2)同化：①脲酶途徑：尿素NH3氨基酸

脲酶水解尿素的毒害：當介質中尿素濃度過高時，植物會出現(xiàn)受害癥狀第17頁,共29頁，2024年2月25日，星期天2.氨基態(tài)氮(aminonitrogen)

可直接吸收，效果因種類而異第一類效果>硫酸銨：如甘氨酸、天門冬酰胺等第二類，尿素<AA效果<硫酸銨：如天門冬氨酸等第三類，效果<尿素：如脯氨酸、纈氨酸等第四類，有抑制作用：如蛋氨酸第18頁,共29頁，2024年2月25日，星期天植物轉氨酶(GOT和GPT)活度比色測定方法及其應及GOGAT酶活性的測定主要試劑(1)0.05mol/LTris-HCL緩沖液(pH7.2):0.2mol/L三羥甲基氨基甲烷(24.2g三羥甲基氨基甲烷用蒸餾水溶解并定容至200ml)50ml和0.2mol/LHCl44.2ml,用蒸餾水稀釋至200ml。(2)0.1mol/L磷酸鹽緩沖液:稱取磷酸氫二鈉(AR)11.928g,磷酸二氫鉀(AR)2.176g,加少量蒸餾水溶解并定容至1000ml。(3)2,4-二硝基苯肼溶液:稱取2,4-二硝基苯肼19.8mg,用10mol/LHCL10ml溶解后,加蒸餾水至100ml,保存于棕色瓶中備用,此液可保存3個月。(4)0.4mol/L氫氧化鈉溶液:16g氫氧化鈉(AR)加蒸餾水溶解并定容至1000ml。第19頁,共29頁，2024年2月25日，星期天(5)1mol/L氫氧化鈉溶液:40g氫氧化鈉(AR)加蒸餾水溶解并定容至1000ml。(6)丙酮酸標準液(2μmol/ml):精確稱取純丙酮酸鈉22.0mg于100ml容量瓶中,加0.1mol/L磷酸鹽緩沖液至刻度。此液應新鮮配制。(7)GOT底物液(DL-門冬氨酸200mmol/L,α-酮戊二酸2mmol/L):稱取α-酮戊二酸29.2mg和DL-門冬氨酸2.66g置于一小燒杯中,加入1mol/L氫氧化鈉20.5ml使溶解,并校正pH至7.4,然后將溶液移入100ml容量瓶內(nèi),用0.1mol/L磷酸鹽緩沖液定容至刻度。放置冰箱內(nèi)保存。(8)GPT底物液:(DL-丙氨酸200mmol/L,α-酮戊二酸2mmol/L):稱取α-酮戊二酸29.2mg和DL-丙氨酸1.79g置于一小燒杯中,加入0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4)約80ml煮沸溶解后,待冷,用1mol/L氫氧化鈉調pH至7.4(約加0.5ml),再加0.1mol/L磷酸鹽緩沖液至100ml混勻,加氯仿數(shù)滴防腐,貯于冰箱內(nèi)。第20頁,共29頁，2024年2月25日，星期天1·酶粗制劑的提取將新鮮植物材料剪碎,取鮮重0.2g左右放入研缽,加0.05mol/LTris-HCl緩沖液(pH7.2)2.0ml,在冰浴中研磨,得到的勻漿用高速離心機20000×g離心20min,上清液供測酶活度用。2·谷草轉氨酶(GOT)活度測定取10ml試管2支,一支作測定管,分別加酶粗制劑0.1ml和GOT底物液0.5ml,另一支作對照管,僅加酶粗制劑0.1ml。將二管同時置37℃水浴,60min后取出,各管加2,4二硝基苯肼液0.5ml終止反應,對照管再加GOT底物液0.5ml。將二管再置37℃水浴中20min,取出后各管加0.4mol/LNaOH5.0ml,混勻,10min后用分光光度計比色,波長500nm,蒸餾水調零點,讀取吸光度。將測定管吸光度減去對照管吸光度,得吸光度差值,查工作曲線即可查得丙酮酸體積(ml)。若查得的丙酮酸體積超過0.2ml時應將酶粗制液稀釋后再進行測定,測定結果乘以稀釋倍數(shù)即得丙酮酸體積V(ml)。第21頁,共29頁，2024年2月25日，星期天工作曲線繪制:取10ml試管5支,各管加0.1mol/L磷酸鹽緩沖液0.1ml,分別加GOT底物液0.5、0.45、0.40、0.35、0.30ml,丙酮酸標準液0(對照管)、0.05、0.10、0.15、0.20ml。置37℃水浴5min,各管加2,4-二硝基苯肼溶液0.5ml,混勻,再置37℃水浴中20min,取出后各管加0.4mol/L氫氧化鈉溶液5ml,混勻,10min后同上比色,讀取各管吸光度。各管吸光度分別減去對照管吸光度,以各管丙酮酸體積為橫座標,以相應的吸光度差值為縱座標繪制工作曲線。3·谷丙轉氨酶(GPT)活度測定取10ml試管2支,一支作測定管,分別加酶粗制劑0.1ml和GPT底物液0.5ml,另一支作對照管,僅加酶粗制劑0.1ml。將二管同時置37℃水浴,30min后取出,各管加2,4-二硝基苯肼液0.5ml終止反應,對照管再加GPT底物液0.5ml。將二管再置37℃水浴中20min,取出后各管加0.4mol/LNaOH5.0ml,混勻,10min后用分光光度計比色,波長500nm,蒸餾水調零點,讀取吸光度。將測定管吸光度減去對照管吸光度,得吸光度差值,查第22頁,共29頁，2024年2月25日，星期天工作曲線即可查得丙酮酸體積(ml),若查得的丙酮酸體積超過0.2ml時應將酶粗制液稀釋后再進行測定,測定結果乘以稀釋倍數(shù)即得丙酮酸體積V(ml)。工作曲線繪制:取10ml試管6支,各管加0.1mol/L磷酸鹽緩沖液0.1ml,分別加GPT底物液0.5、0.45、0.40、0.35、0.30、0.25ml,丙酮酸標準液0(對照管)、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25ml。置37℃水浴中5min,各管加2,4-二硝基苯肼溶液0.5ml,混勻,再置37℃水浴中20min,取出后各管加0.4mol/L氫氧化鈉溶液5ml,混勻,10min后同上比色,讀取各管吸光度。各管吸光度分別減去對照管吸光度,以各管丙酮酸體積為橫座標,以相應的吸光度差值為縱座標繪制工作曲線。(四)結果計算轉氨酶活度以每克植物鮮樣在30min內(nèi)反應生成的丙酮酸微摩爾(μmol)表示。GOT活度,μmol/g·30min=(C×V×20)/(m×2)GPT活度,μmol/g·30min=(C×V×20)/(m×2)式中,C—丙酮酸標準溶液的濃度(μmol/ml);V—由工作曲線查得的丙酮酸體積(ml);20—稀釋倍數(shù);2—反應時間換算系數(shù),GOT實際反應時間為1h,按習慣本法酶活性以30min計算〔4〕,故應除以2;m—植物鮮重(g)第23頁,共29頁，2024年2月25日，星期天粗酶液制備取1g水稻根/葉，置于冰浴的研缽中，加入少量石英砂和3ml提取緩沖液（100mmol/LTris-HCl(pH7.6)含1.0mmol/LEDTA，1.0mmol/LMgCl2·6H2O，10mmol/Lβ-琉基乙醇）于4℃研磨成勻漿?；旌暇鶆蚝笥诟咚倮鋬鲭x心機4℃、20,000g離心20min（13，000g30min），收集上清，即為粗酶提取液，置于-80℃冰箱中凍存，待測。粗酶液用于Gs、NADH-GOGATH的活力測定。第24頁,共29頁，2024年2月25日，星期天提取液配置：（Tris，121.14；EDTA，372.24；MgCl2·6H2O，203.3；β-琉基乙醇原液14.4mol/L）1L提取液的配置：12.114gTris+0.3722gEDTA+0.2033gMgCl2·6H2O用900ml水溶解，+0.7mlβ-琉基乙醇原液后，用1mmol/LHCl調pH值至7.6，然后定容至1L。500ml提取液的配置：6.057gTris+0.1861gEDTA+0.1016gMgCl2·6H2O用450ml水溶解，+0.35mlβ-琉基乙醇原液后，用1mmol/LHCl（原液稀釋12000倍,83ul定容至100ml）調pH值至7.6，然后定容至500ml。第25頁,共29頁，2024年2月25日，星期天GS測定：（1）合成酶活性反應液配制：(50mmol/L咪唑-HCl(pH7.2)含40mmol/LMgSO4,90mmol/LL-谷氨酸,6mmol/L羥胺)(咪唑，68.077；無水氯化鎂，120；L-谷氨酸，147.13；羥胺，33.03)500ml反應液：1.702g咪唑+2.4gMgSO4+6.621gL-谷氨酸+0.099g羥胺用450ml蒸餾水溶解，再用1mMHCl調節(jié)pH至7.2，定容至500mL250ml反應液：0.851g咪唑+1.2gMgSO4+3.311gL-谷氨酸+0.050g羥胺用200ml蒸餾水溶解，再用1mMHCl調節(jié)pH至7.2，定容至250mL（2）10mmol/LATP-Na(3個水，606.24):0.0666g定容至11ml（3）酸性FeC13終止液（2%(WV/)TCA+3.5%(WV/)FeC13·6H2O+2%HCl）配制:2gTCA+3.5gFeC13·6H2O+5.333mlHCl原液（分析純濃鹽酸一般為37.5%，摩爾濃度近似為12mol/L），用蒸餾水溶解后，定容至100ml.（4）測定（1個處理，3個管（1個對照，兩個重復））反應總體積2ml：1.9ml(1ml活性反應液+0.8ml蒸餾水+0.1ml粗酶液)混合液在37℃預熱2-3min后加入0.1ml10mmol/LATP啟動反應?；旌暇鶆蚝?，37℃室溫保溫15min后，立刻加入1mlFeC13終止液終止反應，然后3000g離心5min，上清液于540nm處測定吸光值。空白對照：按順序加入1ml活性反應液+0.8ml蒸餾水+0.1ml10mmol/LATP+1mlFeC13終止液+0.1ml粗酶液，然后3000g離心5min，上清液于540nm處測定吸光值。（5）一個GS活性單位定義為每分鐘于37℃產(chǎn)生1umol的r—谷氨酰異羥肟酸一glutamylhydroxmate)所需的酶量。（6）標準曲線的制作：以r—谷氨酰異羥肟酸做標準曲線取1ml反應液，37℃預保溫，5min后分別加入0，0.5，1.0，1.5，2.0，3，4，5，6，7mM的谷氨?；惲u肟酸1ml，混合均勻后，37℃室溫保溫15min后，立刻加入1mlFeC13終止液終止反應，搖勻后在540nm波長下比色，以蒸餾水作對照，做標準曲線，根據(jù)標準曲線得出谷氨酰基異羥肟酸計算公式：=7.9*OD540-0.162

第26頁,共29頁，2024年2月25日，星期天NADH-GOGAT活性的測定NADH-GOGAT活性測定按singh(1986)報道的方法進行。測活貯備液:A:20mmol/L谷氨酰胺(146.15)0.2923g定容至100mlB:100mmol/La-酮戊二酸(146.11)1.4611g定容至100mlC:10mmol/LKCl(74.551)0.0745g定容至100mlD:25mmol/LTris-HCl緩沖液(pH7.6)1.514g定容至500mlE:3mmol/LNADH(新鮮配制)(709.4)0.017g定容至8ml空白對照為0.4mL(A)+0.05mL(B)+0.lmL(C)+2.45mL(D)。測活管:0.05mLB+0.lmLC+1.95mLD(測定前可以按照10:20:390比例混勻后，取混合液2.1ml)30℃水浴中預熱幾分鐘后,按順序加入0.2mLE和0.3mL酶液,再加入0.4mLA,混勻,立即啟動反應，紫外分光光度計在340nm處測光吸收,倒回試管,30℃水浴,三分鐘后再測一次光吸收,計算差值。NADH-GOGAT酶活性單位定義為:每分鐘反應混合液于30℃減少1umolNADH為一個酶活性單位。第27頁,共29頁，2024年2月25日，星期天NADH-GDH活性的測定:NADH-GDH(還原型GDH)和NAD+-GDH(氧