化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)

關(guān)于化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)：集靈敏的化學(xué)發(fā)光分析和特異的抗原抗體免疫測定于一體的檢測技術(shù)。概念特點：特異性高、敏感性高、分離簡便、快速、試劑無毒、安全穩(wěn)定、可自動化。第2頁,共27頁，2024年2月25日，星期天化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的類型按發(fā)光劑不同分為

1.發(fā)光酶免疫測定（CLEIA）

chemiluminescenceenzymeimmunoasssay

2.化學(xué)發(fā)光免疫測定技術(shù)(CLIA)chemiluminescenceimmunoassay

3.電化學(xué)發(fā)光免疫測定技術(shù)(ECLI)electrochemiluminescenceimmunoassay

按分離方法不同分

1.微粒子化學(xué)發(fā)光免疫測定

2.磁顆?；瘜W(xué)發(fā)光免疫測定第3頁,共27頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)發(fā)光與化學(xué)發(fā)光劑一、發(fā)光一種物質(zhì)由電子激發(fā)態(tài)回復(fù)到基態(tài)時，釋放出的能量表現(xiàn)為光的發(fā)射。1.光照發(fā)光:發(fā)光劑經(jīng)短波長入射光照射后進(jìn)入激發(fā)態(tài)，當(dāng)回復(fù)至基態(tài)時發(fā)出較長波長的可見光。2.生物發(fā)光:反應(yīng)底物在熒光素酶的催化下利用

ATP產(chǎn)能，生成激發(fā)態(tài)的氧化熒光素，后者在回復(fù)到基態(tài)時多余的能量以光子形式放出。3.化學(xué)發(fā)光:在常溫下由化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的光的發(fā)射?；瘜W(xué)發(fā)光是一個多步驟的過程。第4頁,共27頁，2024年2月25日，星期天

熒光素酶ATP；O2；Mg2+氧化螢火蟲熒光素螢火蟲熒光素生物發(fā)光返回光+AMP+O2+CO2+第5頁,共27頁，2024年2月25日，星期天化學(xué)發(fā)光

機(jī)制：某些化合物可以利用化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的能量使其產(chǎn)物分子或反應(yīng)中間態(tài)分子上升至電子激發(fā)態(tài)。當(dāng)此產(chǎn)物分子或中間態(tài)分子衰退至基態(tài)時，以發(fā)射光子的形式釋放能量（即發(fā)光）。二、化學(xué)發(fā)光劑化學(xué)發(fā)光劑或發(fā)光底物：在化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中參與能量轉(zhuǎn)移并最終以發(fā)射光子的形式釋放能量的化合物。發(fā)光劑分為熒光素、生物發(fā)光劑、化學(xué)發(fā)光劑第6頁,共27頁，2024年2月25日，星期天①能參與化學(xué)發(fā)光反應(yīng)；②與抗原或抗體偶聯(lián)后形成穩(wěn)定的結(jié)合物試劑；③偶聯(lián)后仍保留高的量子效應(yīng)和反應(yīng)動力；④應(yīng)不改變或極少改變被標(biāo)記物的理化特性，特別是免疫活性。化學(xué)發(fā)光劑應(yīng)符合以下幾個條件返回第7頁,共27頁，2024年2月25日，星期天1.酶促反應(yīng)的發(fā)光底物是指經(jīng)酶的降解作用而發(fā)出光的一類發(fā)光底物。

CLEIA中常用的酶有HRP和APHRP的發(fā)光底物有魯米諾、對-羥基苯乙酸

AP的發(fā)光底物有AMPPD、4-MUP（熒光底物）特點：可作標(biāo)記物、也可作過氧化物酶的底物

1.1魯米諾H2O2/OH—HRP+N2+H2O

+光第8頁,共27頁，2024年2月25日，星期天對-羥基苯乙酸（HPA）

HPA在H2O2存在下被HRP氧化成氧化二聚體（熒光物質(zhì)），在350nm激發(fā)光作用下，發(fā)出450nm波長的熒光，可用熒光光度計測量。

1.2HPAH2O2HRP+熒光氧化二聚體第9頁,共27頁，2024年2月25日，星期天AMPPD

AMPPD在堿性條件下，被AP酶解生成相當(dāng)穩(wěn)定的

AMP-D陰離子，其有2～30min的分解半衰期，發(fā)出波長為470nm的持續(xù)性光，在15min時其強(qiáng)度達(dá)到高峰，15～60min內(nèi)光強(qiáng)度保持相對穩(wěn)定。光AP

/OH—HPO42—

1.3AMPPD第10頁,共27頁，2024年2月25日，星期天4-MUP發(fā)出448nm的熒光4-MUP被AP催化生成4-甲基傘形酮，在360nm的激發(fā)光的作用下，，可用熒光光度計進(jìn)行測量。熒光AP

1.44-MUP4-MU360nm激發(fā)光H3PO4+第11頁,共27頁，2024年2月25日，星期天2.直接化學(xué)發(fā)光劑特點：不需催化劑，只需改變?nèi)芤旱膒H等條件就能發(fā)光的物質(zhì)。反應(yīng)迅速、背景低、信比高，發(fā)光量與AE濃度呈線性關(guān)系。常用試劑：吖啶酯（acridinium，AE）+CO2+光第12頁,共27頁，2024年2月25日，星期天3.電化學(xué)發(fā)光劑是指通過在電極表面進(jìn)行電化學(xué)反應(yīng)而發(fā)出光的物質(zhì)。特點：①反應(yīng)在電極進(jìn)行；②電子供體為：三丙胺（TPA）③化學(xué)發(fā)光劑：三聯(lián)毗啶釕返回三聯(lián)毗啶釕分子結(jié)構(gòu)圖第13頁,共27頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)發(fā)光酶免疫測定（CLEIA）一、原理屬于酶免疫測定的一種。只是最后一步酶反應(yīng)所用底物為發(fā)光劑，通過發(fā)光反應(yīng)發(fā)出的光在特定的儀器上進(jìn)行測定。二、技術(shù)類型

根據(jù)酶促反應(yīng)底物不同可分為：

1.熒光酶免疫測定技術(shù)

2.化學(xué)發(fā)光酶免疫測定技術(shù)根據(jù)免疫學(xué)反應(yīng)模式分

1.雙抗體夾心法和雙抗原夾心法

3.固相抗原競爭法：第14頁,共27頁，2024年2月25日，星期天熒光酶免疫測定技術(shù)反應(yīng)原理圖洗滌棄上清是利用理想的酶熒光底物，生成的產(chǎn)物穩(wěn)定并有強(qiáng)的熒光強(qiáng)度，通過測定熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量。第15頁,共27頁，2024年2月25日，星期天化學(xué)發(fā)光酶免疫測定技術(shù)反應(yīng)原理圖洗滌棄上清是利用酶對發(fā)光底物催化作用而直接發(fā)光，通過光強(qiáng)度的測定而直接進(jìn)行定量。第16頁,共27頁，2024年2月25日，星期天電化學(xué)發(fā)光原理圖這一過程可在電極表面周而復(fù)始地進(jìn)行產(chǎn)生許多光子，使光信號增強(qiáng)

返回激發(fā)態(tài)不穩(wěn)定基態(tài)電極第17頁,共27頁，2024年2月25日，星期天1.抗原抗體結(jié)合反應(yīng)將已包被了抗體的乳膠微粒和待測標(biāo)本加入反應(yīng)杯中，經(jīng)溫育一定時間后,再加入AP標(biāo)記抗體，溫育,形成固相包被抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物技術(shù)要點2.分離技術(shù)將復(fù)合物轉(zhuǎn)移到玻璃纖維上，用緩沖液洗滌，沒結(jié)合的抗原被洗脫，酶標(biāo)抗體-抗原-膠乳微?？贵w復(fù)合物則被保留在纖維膜上。3.酶促發(fā)光反應(yīng)

加入4-MUP，酶標(biāo)抗體上AP將

4-MUP分解，形成4-MU，它在360nm激發(fā)光的照射下，發(fā)出448nm的熒光，經(jīng)熒光儀記錄，放大，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線由電腦計算出所測物質(zhì)的含量第18頁,共27頁，2024年2月25日，星期天1.磁顆粒分離法：用抗原或抗體包被磁顆粒,與標(biāo)本中相應(yīng)抗原或抗體和酶標(biāo)的抗體或抗原通過一定模式的免疫學(xué)反應(yīng)后,最終通過磁場將結(jié)合酶標(biāo)記物IC和游離酶標(biāo)記物進(jìn)行分離的技術(shù)。分離技術(shù)2.微粒子捕獲法：所用顆粒是無磁性微粒子作為抗體或抗原的包被載體,然后用纖維膜柱子進(jìn)行酶標(biāo)記物的結(jié)合狀態(tài)和游離狀態(tài)的分離。3.包被珠分離法：用聚苯乙稀等材料制成小珠,在小珠上包被抗原或抗體,經(jīng)抗原抗體反應(yīng)后,將結(jié)合狀態(tài)和游離狀態(tài)的酶標(biāo)記物進(jìn)行分離.第19頁,共27頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)化學(xué)發(fā)光免疫測定技術(shù)（CLIA）一、原理用化學(xué)發(fā)光劑直接標(biāo)記抗原或抗體,與待測標(biāo)本中相應(yīng)Ab或Ag、磁顆粒性的Ag或Ab反應(yīng)，通過磁場把結(jié)合狀態(tài)（沉淀部分）和游離狀態(tài)的化學(xué)發(fā)光劑標(biāo)記物分離開來，然后加入發(fā)光促進(jìn)劑進(jìn)行發(fā)光反應(yīng)，通過對發(fā)光強(qiáng)度的檢測進(jìn)行定量或定性檢測。二、技術(shù)類型

1.分離方法常用磁顆粒分離技術(shù)

2.免疫學(xué)反應(yīng)模式同酶發(fā)光免疫測定技術(shù)

3.不同只是相應(yīng)標(biāo)記物是吖啶酯而不是酶第20頁,共27頁，2024年2月25日，星期天1.抗原抗體結(jié)合反應(yīng)將包被McAb的磁顆粒和待測標(biāo)本加入到反應(yīng)管中，標(biāo)本中待測Ag與磁珠上Ab結(jié)合，再加上AE標(biāo)記Ab，經(jīng)過溫育，形成磁珠Ab-Ag-AE標(biāo)記Ab復(fù)合物。技術(shù)要點2.分離技術(shù)在電磁場中進(jìn)行2-3次洗滌后，很快地將未結(jié)合的多余Ag和標(biāo)記Ab洗去。3.化學(xué)發(fā)光反應(yīng)經(jīng)洗滌的磁珠中，加入H2O2和

pH糾正液NaOH，這時AE不需要催化劑即分解并發(fā)光，由集光器接收，經(jīng)光電倍增管放大，記錄1S內(nèi)所產(chǎn)生的光子能，其積分與被測物含量成正比，按標(biāo)準(zhǔn)曲線，儀器可計算出被測物含量。第21頁,共27頁，2024年2月25日，星期天

1.AE其低背景噪音、化學(xué)反應(yīng)簡單、快速而無催化劑。方法評價2.AE與大分子的結(jié)合并無減少所產(chǎn)生的光量，從而增加靈敏度，靈敏度可達(dá)10-15g/ml。3.AE標(biāo)記試劑有效期長，可達(dá)一年。4.固相分離劑為極為幼細(xì)的磁粉，除增大包被面積，加快反應(yīng)外，亦同時使清洗及分離更簡易、快捷。第22頁,共27頁，2024年2月25日，星期天第四節(jié)電化學(xué)發(fā)光免疫測定技術(shù)（ECLI）一、原理是一種在電極表面由電化學(xué)引發(fā)的特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，實際上包括了電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光二個過程。ECL是電啟動發(fā)光反應(yīng)，而CL

是通過化合物混合啟動發(fā)光反應(yīng)。用化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕[Ru(bpy)3]2+標(biāo)記Ab，通過Ag-Ab

反應(yīng)和磁珠分離技術(shù)，根據(jù)三聯(lián)吡啶釕在電極上發(fā)出的光強(qiáng)度對待測的Ag或Ab進(jìn)行定量/定性。二、技術(shù)類型

1.分離方法常用磁顆粒分離技術(shù)

2.免疫學(xué)反應(yīng)模式同酶發(fā)光免疫測定技術(shù)

3.相應(yīng)標(biāo)記物是三聯(lián)吡啶釕而不是酶第23頁,共27頁，2024年2月25日，星期天

1.三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記抗體和生物素標(biāo)記抗體與待測標(biāo)本同時加入一個反應(yīng)杯中孵育反應(yīng)技術(shù)要點

2.將鏈霉親和素（SA）包被磁珠加入反應(yīng)杯中，再次孵育，使生物素（B）通過與親和素（A）的結(jié)合，將磁珠、Ab連接為一體，形成雙Ab夾心法。

3.蠕動泵將形成的[Ru(bpy)3]2+-Ab-Ag-Ab-B-SA-磁珠復(fù)合體吸入流動測量室，磁珠被工作電極下面的磁鐵吸附于電極表面。同時，游離的Ab也被吸出測量室。

4.蠕動泵加入TPA，電極加電壓，啟動ECL反應(yīng)過程。該過程在電極表面周而復(fù)始地進(jìn)行，產(chǎn)生許多光子，光電倍增管檢測光強(qiáng)度，其與[Ru(bpy)3]2+的濃度呈線性關(guān)系,故可測出待測Ag的含量。第24頁,共27頁，2024年2月25日，星期天原理圖返回抗體包被樣本Ru(byp)2+TPA緩沖的磁珠抗原標(biāo)記抗體液洗滌3第25頁,共27頁，2024年2月25日，星期天方法評價①標(biāo)記物的再循環(huán)利用，使發(fā)光時間更長、強(qiáng)度更高、易于測定；②敏感度高，可達(dá)pg／ml或pmol水平；③線性范圍寬＞104；④反應(yīng)時間短，