維生素B1（VitaminB1VB1）試劑盒說明書

第第頁維生素B1（VitaminB1，VB1）試劑盒說明書維生素B1（VitaminB1，VB1）試劑盒說明書微量法100T/96S注意：正式測定之前選擇23個預(yù)期差別大的樣本做猜測定。測定意義：維生素B1（VitaminB1）是構(gòu)成脫羧輔酶的重要成分，參加細(xì)胞代謝中的三羧酸循環(huán)，是維持機(jī)體正常代謝必需的水溶性維生素，在生物體能量代謝中有緊要的作用。測定原理：VB1在堿性條件下還原鐵氰hua鉀生成亞鐵氰hua鉀，亞鐵氰hua鉀與Fe3+在弱酸條件下生成普魯士藍(lán)，在704nm有特征汲取峰。自備試驗(yàn)用品及儀器：天平、研缽、離心機(jī)、可見分光光度計/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、恒溫水浴鍋、蒸餾水。試劑構(gòu)成和配制：提取液：液體70mL×1瓶，4℃保管。試劑一：液體1mL×1瓶，4℃保管。試劑二：液體2mL×1支，4℃保管。試劑三：液體2mL×1瓶，4℃避光保管。試劑四：液體5mL×1瓶，4℃保管。試劑五：液體3mL×1瓶，4℃避光保管。樣本處理：1.組織：將樣品磨碎，依照質(zhì)量（g）：提取液體積（mL）為1：5～10的比例（建議稱取約0.1g，加入0.6mL提取液）加入提取液，60℃浸提30min，加蒸餾水0.4mL，混勻后于25℃，16000rpm離心10min，取上清測定（動物組織等蛋白含量較高的樣本建議離心2030min）。2.細(xì)胞：依照細(xì)胞數(shù)量（104個）：提取液體積（mL）為500～1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入0.6mL提取液），冰浴超聲波碎裂細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；加蒸餾水0.4mL，混勻后于25℃，16000rpm離心10min，取上清測定。3.血清：直接測定。測定操作：空白管測定管樣品（μL）20試劑一（μL）20試劑二（μL）1616試劑三（μL）2020充分混勻，80℃反應(yīng)10min提取液（μL）1616試劑四（μL）4444試劑五（μL）2424H2O（μL）6060充分混勻，靜置20min，于微量石英比色皿/96孔板，蒸餾水調(diào)零，測定704nm處吸光值，記為A空白管和A測定管，△A=A測定管A空白管。計算公式：a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.017x+0.0031，R2=0.9991；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度：μg/mL；y為△A（A測定管A空白管）1.依照蛋白含量計算VB1含量（μg/mgprot）=（△A0.0031）÷0.017÷Cpr=58.8×（△A0.0031）÷Cpr2.依照樣本質(zhì)量計算VB1含量（μg/g鮮重）=（△A0.0031）÷0.017÷（W÷V樣總）=58.8×（△A0.0031）÷W3.依照細(xì)胞數(shù)量計算VB1含量（μg/104cell）=（△A0.0031）÷0.017÷（細(xì)胞數(shù)量÷V樣總）=58.8×（△A0.0031）÷細(xì)胞數(shù)量4.依照液體體積計算VB1含量（μg/mL）=（△A0.0031）÷0.017=58.8×（△A0.0031）V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，gb．用96孔板測定的計算公式如下標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.0085x+0.0031，R2=0.9991；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度：μg/mL；y為△A（A測定管A空白管）1.依照蛋白含量計算VB1含量（μg/mgprot）=（△A0.0031）÷0.0085÷Cpr=117.65×（△A0.0031）÷Cpr2.依照樣本質(zhì)量計算VB1含量（μg/g鮮重）=（△A0.0031））÷0.0085÷（W÷V樣總）=117.65×（△A0.0031）÷W3.依照細(xì)胞數(shù)量計算VB1含量（μg/104cell）=（△A0.0031）÷0.0085÷（細(xì)胞數(shù)量÷V樣總）=117.65×（△A0.0031）÷細(xì)胞數(shù)量4.依照液體體積計算VB1含量（μg/mL）=（△A0.0031）÷0.0085=117.65×（△A0.0031）V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g注意事項：1.若測定結(jié)果中吸光值超出2，請將樣本稀釋后進(jìn)行測定，并在計算公式中乘以稀釋倍數(shù)。2.