小鼠骨髓細(xì)胞的染色體制備

小鼠骨髓細(xì)胞的染色體制備

實驗?zāi)康呐c要求掌握低滲法制備動物骨髓細(xì)胞染色體的方法。觀察小白鼠染色體的形態(tài)特征和染色體數(shù)目，并驗證實驗小鼠的雌雄。實驗原理秋水仙素可破壞骨髓細(xì)胞分裂過程中紡錘體的形成，把分裂的細(xì)胞阻截在中期，此時染色體達(dá)到最大收縮，具有典型的形態(tài)和特征。通過對小鼠骨髓細(xì)胞的低滲、滴片、染色等處理，可觀察小鼠染色體。低滲使細(xì)胞膨脹，染色體松散；高空滴片時染色體進(jìn)一步完全散開；再通過冷熱處理；使細(xì)胞膜及核膜破裂。實驗材料、器材和所需藥品健康小白鼠（雌雄均可）、解剖刀、解剖盤、解剖剪、鑷子、吸管注射器（5-10mL）、離心管（10mL）、燒杯（100mL）、37℃恒溫水浴鍋、普通離心機(jī)、顯微鏡、1:10的Giemsa磷酸鹽緩沖液、秋水仙素（濃度為0.01%）、KCl（濃度為0.075mol/L）、生理鹽水(濃度為0.85%)、固定液（甲醇：醋酸=3:1）、冰凍載玻片、吸管、量筒、酒精燈、吸水紙、擦鏡紙實驗步驟預(yù)處理→取股骨→沖洗骨髓→離心→低滲→離心→固定→離心→滴片→染色→觀察

實驗方法秋水仙素注射：選擇健康的小白鼠（約20g重），在實驗前約2-3h，按2-4ug/g體重的劑量經(jīng)腹腔注射秋水仙素。斷頸法處死小鼠。2、取股骨：用解剖剪刀剪取小鼠大腿骨，用剪刀剔除掉肌肉（盡量剔除干凈?。?。3、低滲：將剔除掉肌肉的2個腿骨放于培養(yǎng)皿（盛有預(yù)先于37℃溫育的2mL的KCl溶液）中，用剪刀將腿骨剪碎（盡量剪得很碎?。缓蟮蜐B處理15min。4、將低滲后的上清液（不要骨頭）倒入離心管，再加入1mL固定液，平衡后放入離心機(jī)，以1500r/min離心6min。5、第一次固定：棄上清，沉淀再加入3mL固定液，吹打勻，靜置固定10min，平衡后放入離心機(jī)，以1500r/min離心6min。6、第二次固定：棄上清，再加入3mL固定液，吹打勻，靜置固定10min，平衡后放入離心機(jī)，以1500r/min離心6min。7、制備細(xì)胞懸浮液：棄上清，將上清液倒盡，加入0.5mL固定液，用槍吹打開。8.滴片：用鑷子取預(yù)先冰凍的干凈載玻片，用吸管將溶液迅速滴上2-3滴細(xì)胞懸浮液，立即用另一載波片將溶液展開，使細(xì)胞分散均勻，然后晾干，或置酒精燈上微微加熱干燥。共滴2張片。9、染色：將晾干后的載波片滴加染色液2-3滴覆蓋樣品、染色15min。10、染色后,水洗，涼干后即可鏡檢。。11、鏡檢：在低倍鏡下找到中期分裂相的細(xì)胞，轉(zhuǎn)用高倍鏡，選擇染色體分散適度、長度適中的分裂相進(jìn)行觀察。制備方法包括以下幾個要點:

1.用一定劑量的秋水仙素破壞紡錘絲的形成，使細(xì)胞分裂停滯在中期,使中期染色體停留在赤道面處。

2.用低滲法使將細(xì)胞膨脹,以至于在滴片時細(xì)胞被脹破,使細(xì)胞的染色體鋪展到載玻片上。

3.空氣干燥法可使細(xì)胞的染色體在載片上展平,經(jīng)Giemsa染色后便可觀察到染色體的顯微圖象。

五、注意事項

低滲與離心等步驟的操作要輕。

觀察細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)為：

1．細(xì)胞完整，輪廓清晰，染色體分布在同一水平面上。

2．染色體形態(tài)和分布良好。

3．最好無重疊，即使有個別重疊，也要能明確辯認(rèn)，以免差錯。

4．所觀察的細(xì)胞處于同一有絲分裂階段，即染色體螺旋化程度或染色體長短大致一樣。

腫瘤細(xì)胞染色體制備與觀察

實驗原理、實驗材料、器材和所需藥品：見小鼠骨髓細(xì)胞染色體標(biāo)本的制備與分析實驗實驗方法1、腫瘤細(xì)胞株接種于小鼠腹腔，在實驗前約3-4h，按2-4ug/g體重的劑量經(jīng)腹腔注射秋水仙素。斷頸法處死小鼠。2、收集腫瘤細(xì)胞腹水，倒入離心管內(nèi)，稀釋至50ml。3、取上述細(xì)胞液1ml，離心6分鐘(1500r/min)，收集沉淀物，棄去上清液。加低滲KCl處理15min。離心→低滲→離心→固定