遺傳標(biāo)記的原理及其應(yīng)用

遺傳標(biāo)記的原理及其應(yīng)用PCR技術(shù)的產(chǎn)生第2頁,共96頁，2024年2月25日，星期天PCR技術(shù)的原理PCR原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制。第3頁,共96頁，2024年2月25日，星期天PCR的原理第4頁,共96頁，2024年2月25日，星期天第5頁,共96頁，2024年2月25日，星期天PCR循環(huán)–第一步–加熱變性第6頁,共96頁，2024年2月25日，星期天PCR循環(huán)—第二步—引物與靶序列退火第7頁,共96頁，2024年2月25日，星期天PCR循環(huán)-

第三步-

引物延伸第8頁,共96頁，2024年2月25日，星期天第1個(gè)PCR循環(huán)完成后–

得到兩個(gè)拷貝的靶序列第9頁,共96頁，2024年2月25日，星期天No.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,824第10頁,共96頁，2024年2月25日，星期天PCR擴(kuò)增原理引物延伸延伸5’5’3’3’變性、退火變性、退火第11頁,共96頁，2024年2月25日，星期天第12頁,共96頁，2024年2月25日，星期天特異性強(qiáng)：引物與模板DNA按照堿基互補(bǔ)配對原則結(jié)合，耐熱DNA聚合酶使整個(gè)反應(yīng)可在較高溫度下進(jìn)行，結(jié)合的特異性大大提高。靈敏度高：理論上可從100萬個(gè)細(xì)胞中檢測出1個(gè)靶細(xì)胞簡便迅速：一個(gè)PCR反應(yīng)約需要2～4小時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物可直接電泳分析，直觀、便捷。對模板要求低：不需特殊方法分離病毒、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞，DNA粗制品即可作為擴(kuò)增的模板PCR技術(shù)的特點(diǎn)第13頁,共96頁，2024年2月25日，星期天PCR擴(kuò)增過程圖示第14頁,共96頁，2024年2月25日，星期天平臺(tái)效應(yīng)“平臺(tái)效應(yīng)”：PCR反應(yīng)中，當(dāng)引物－模板與DNA聚合酶達(dá)到一定比值時(shí)，DNA聚合酶催化反應(yīng)趨于飽和，即PCR反應(yīng)不再增加。第15頁,共96頁，2024年2月25日，星期天PCR反應(yīng)成分DNA聚合酶dNTPs模板引物第16頁,共96頁，2024年2月25日，星期天PCR反應(yīng)系統(tǒng)的組成10×擴(kuò)增緩沖液10ul

4種dNTP混合物各200umol/L

引物各10～100pmol

模板DNA

0.1～2ug

TaqDNA聚合酶2.5u

Mg2+

1.5mmol/L

加雙或三蒸水至100ul

一、PCR反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)體系第17頁,共96頁，2024年2月25日，星期天二、關(guān)于緩沖系統(tǒng)10×擴(kuò)增緩沖液的成分通常含有適量的KCl,MgCl2,Tris-HCl。Tris緩沖液是一種雙極化離子緩沖液，它能有效地調(diào)節(jié)pH，使其維持在DNA聚合酶活性所要求的偏堿性環(huán)境；鎂離子是DNA聚合酶的活性所必須的，它既影響到反應(yīng)的擴(kuò)增效率，也影響反應(yīng)的特異性，過量的鎂離子常常引起非特異性擴(kuò)增反應(yīng)；KCl的作用是促進(jìn)引物退火。第18頁,共96頁，2024年2月25日，星期天PCR反應(yīng)中的模板可以是來源于任何生物的單鏈及雙鏈DNA。PCR對模板純度要求不高。樣品中存在一定量的蛋白質(zhì)或有機(jī)物對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響不大，甚至可以將細(xì)胞裂解物直接用于擴(kuò)增，有DNA部分降解的樣品，也可以作為模板使用。但是樣品中不能含有某種可抑制DNA聚合酶活性的雜質(zhì)。PCR反應(yīng)中，起始模板的用量，理論上講可以少到僅有一個(gè)有效的單一分子。為了獲得高質(zhì)量和高效率的擴(kuò)增，模板用量可為納克或微克水平。三、關(guān)于模板第19頁,共96頁，2024年2月25日，星期天引物引物3’5’5’5’基因組第20頁,共96頁，2024年2月25日，星期天引物的序列應(yīng)位于基因組DNA的高度保守區(qū)，且與非擴(kuò)增區(qū)無同源序列這樣可以減少引物與基因組的非特異性結(jié)合，提高反應(yīng)的特異性引物長度：15－40bp，常用為２０bp左右引物過短或過長均可使反應(yīng)的特異性下降。四、關(guān)于引物－引物的設(shè)計(jì)原則(Cont.)第21頁,共96頁，2024年2月25日，星期天引物的堿基盡可能隨機(jī)發(fā)布避免出現(xiàn)數(shù)個(gè)嘌呤或嘧啶的連續(xù)排列，G+C堿基的含量在40％－６０％之間，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。引物內(nèi)部應(yīng)避免形成二級(jí)結(jié)構(gòu)特別是引物的末端應(yīng)避免有回文結(jié)構(gòu)。四、關(guān)于引物－引物的設(shè)計(jì)原則(Cont.)第22頁,共96頁，2024年2月25日，星期天二個(gè)引物不應(yīng)有互補(bǔ)序列特別是3’端應(yīng)避免互補(bǔ)，以免形成“引物二聚體”，浪費(fèi)引物。引物5’末端堿基無嚴(yán)格限制在與模板DNA結(jié)合的引物長度足夠的條件下，其5’端堿基可不與模板DNA互補(bǔ)而呈游離狀態(tài)，因此可在引物5’端加上限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)、啟動(dòng)子序列或其它序列等以便于PCR產(chǎn)物的分析克隆等，引物的5’端最多可加10個(gè)堿基而對PCR反應(yīng)無影響。四、關(guān)于引物－引物的設(shè)計(jì)原則(Cont.)第23頁,共96頁，2024年2月25日，星期天3’5’3’5’限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列啟動(dòng)子序列定點(diǎn)突變探針標(biāo)記第24頁,共96頁，2024年2月25日，星期天引物擴(kuò)增跨度以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長至10kb的片段。引物3‘端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗。四、關(guān)于引物－引物的設(shè)計(jì)原則(Cont.)第25頁,共96頁，2024年2月25日，星期天PCR擴(kuò)增條件變性退火延伸始變性９４度５分鐘主循環(huán)９４度１分鐘５０度１分鐘７２度１分鐘終延伸７２度１０分鐘一、PCR熱循環(huán)中的標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)主循環(huán)周期通常選定為25～30個(gè)循環(huán)。循環(huán)周期較多，可能獲得較多的產(chǎn)物，但隨之而來的堿基錯(cuò)配的概率也會(huì)增大，故在要求高保真擴(kuò)增的實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)盡可能用較少的循環(huán)周期。第26頁,共96頁，2024年2月25日，星期天1234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍第27頁,共96頁，2024年2月25日，星期天試驗(yàn)者應(yīng)根據(jù)自己的引物Tm值及實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行設(shè)定退火溫度，退火時(shí)間選擇范圍是３０秒到１分鐘。延伸溫度通常變化不大，延伸時(shí)間應(yīng)該根據(jù)欲擴(kuò)增的靶序列的長度進(jìn)行調(diào)整，一般按每分鐘合成１０００個(gè)堿基的速率來計(jì)算，二、關(guān)于退火和延伸第28頁,共96頁，2024年2月25日，星期天分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的最常用方法是凝膠電泳分析法。帶電顆粒在電場的作用下，向著與其電性相反的電極方向移動(dòng)，這種現(xiàn)象稱之為電泳(electrophoresis，簡稱EP)。凝膠電泳分析包括瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳。聚丙烯酰胺凝膠電泳靈敏度高，但操作復(fù)雜。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析第29頁,共96頁，2024年2月25日，星期天第30頁,共96頁，2024年2月25日，星期天第31頁,共96頁，2024年2月25日，星期天電泳技術(shù)就是根據(jù)各種帶電粒子在電場中遷移速度的不同而對物質(zhì)進(jìn)行分離的一類實(shí)驗(yàn)技術(shù)。帶電顆粒在電場中移動(dòng)是物質(zhì)的一種運(yùn)動(dòng)現(xiàn)象。移動(dòng)的速度與顆粒帶電的強(qiáng)弱、分離介質(zhì)的阻力、電極液的粘度和電場強(qiáng)度等因素有關(guān)。生物大分子在電場中移動(dòng)的速度除上述因素外還與分子形狀、相對分子質(zhì)量大小、分子的帶電性質(zhì)及數(shù)目等因素有關(guān)。一、電泳的原理第32頁,共96頁，2024年2月25日，星期天核酸分子中的糖-磷酸骨架中的磷酸基團(tuán)帶有負(fù)電荷，因此當(dāng)核酸分子被放置在電場當(dāng)中時(shí)，它們就會(huì)向正電極的方向遷移。在凝膠濃度和電場強(qiáng)度一定的情況下，DNA分子的這種遷移速度，取決于核酸分子本身的大小和構(gòu)型。分子量較小的DNA分子，比分子量較大的DNA分子遷移快，雙鏈環(huán)狀DNA比同等分子量的松散型的開環(huán)DNA分子或線性DNA分子要快些，這就是應(yīng)用凝膠電泳技術(shù)分離DNA片段的基本原理。一、電泳的原理第33頁,共96頁，2024年2月25日，星期天二、瓊脂糖濃度的選擇片斷大小瓊脂濃度（％）５０～５００2.0５００～１０００1.5１０００～５０００1.0>５０００0.6第34頁,共96頁，2024年2月25日，星期天三、關(guān)于EBEB是一種具扁平分子的核酸染料，可以插入到DNA或RNA分子的堿基之間，并在300nm波長的紫外光照射下放射出熒光，所以可用來顯現(xiàn)瓊脂糖凝膠中的核酸分子。當(dāng)把含有DNA分子的凝膠浸泡在EB的溶液中，或是將EB直接加到DNA的凝膠介質(zhì)中，此種染料便會(huì)在一切可能的部位同DNA分子結(jié)合，然而卻不能同瓊脂糖凝膠結(jié)合，因此在紫外光的照射下，只有DNA分子通過放射熒光而變成可見的譜帶。而且在適當(dāng)?shù)娜旧珬l件下，熒光的強(qiáng)度是同DNA片段的大?。ɑ驍?shù)量）成正比。在包含有數(shù)種DNA片段的電泳譜帶中，每一條帶的熒光強(qiáng)度是隨著從最大的DNA片段到最小的DNA片段方向逐漸降低的。換言之，在一定程度上，電泳譜帶的熒光強(qiáng)度是同DNA片段的大小成正比的。第35頁,共96頁，2024年2月25日，星期天第36頁,共96頁，2024年2月25日，星期天EB染色原理第37頁,共96頁，2024年2月25日，星期天四、電泳系統(tǒng)—電泳儀第38頁,共96頁，2024年2月25日，星期天四、電泳系統(tǒng)—電泳槽垂直電泳槽水平電泳槽第39頁,共96頁，2024年2月25日，星期天第40頁,共96頁，2024年2月25日，星期天PCR技術(shù)的基本過程(1)模板DNAdNTP引物Buffer預(yù)變性模板DNAdNTP引物Buffer94oC5’基本過程第41頁,共96頁，2024年2月25日，星期天PCR技術(shù)的基本過程(2)Taq酶模板DNAdNTP引物Buffer循環(huán)儀94℃55℃72℃Taq酶模板DNAdNTP引物Buffer72℃5～7min循環(huán)25～35次第42頁,共96頁，2024年2月25日，星期天瓊脂糖凝膠電泳PCR技術(shù)的基本過程(3)第43頁,共96頁，2024年2月25日，星期天PCR常見問題問題一：無擴(kuò)增產(chǎn)物模板:含有抑制物，含量低Buffer對樣品不合適引物設(shè)計(jì)不當(dāng)或者發(fā)生降解反應(yīng)條件：退火溫度太高，延伸時(shí)間太短

原因?qū)Σ呒兓０寤蛘呤褂迷噭┖刑崛∧０錎NA或加大模板的用量更換Buffer或調(diào)整濃度重新設(shè)計(jì)引物（避免鏈間二聚體和鏈內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu)）或者換一管新引物降低退火溫度、延長延伸時(shí)間現(xiàn)象：正對照有條帶，而樣品則無；第44頁,共96頁，2024年2月25日，星期天

問題二：非特異性擴(kuò)增

現(xiàn)象：PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。第45頁,共96頁，2024年2月25日，星期天引物特異性差模板或引物濃度過高酶量過多Mg2+濃度偏高退火溫度偏低循環(huán)次數(shù)過多

原因?qū)Σ咧匦略O(shè)計(jì)引物或者使用巢式PCR適當(dāng)降低模板或引物濃度適當(dāng)減少酶量降低鎂離子濃度適當(dāng)提高退火溫度或使用二階段溫度法減少循環(huán)次數(shù)

問題二：非特異性擴(kuò)增第46頁,共96頁，2024年2月25日，星期天

問題三：拖尾

現(xiàn)象：產(chǎn)物在凝膠上呈Smear狀態(tài)。M12第47頁,共96頁，2024年2月25日，星期天模板不純Buffer不合適退火溫度偏低酶量過多dNTP、Mg2+濃度偏高循環(huán)次數(shù)過多

原因?qū)Σ呒兓０甯鼡QBuffer適當(dāng)提高退火溫度適量用酶適當(dāng)降低dNTP和鎂離子的濃度減少循環(huán)次數(shù)

問題三：拖尾第48頁,共96頁，2024年2月25日，星期天

問題四：假陽性（篩選轉(zhuǎn)基因、檢測基因表達(dá)情況)

原因：靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染

現(xiàn)象：空白對照出現(xiàn)目的擴(kuò)增產(chǎn)物第49頁,共96頁，2024年2月25日，星期天

對策：操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外；除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及加樣槍頭等均應(yīng)一次性使用。各種試劑最好先進(jìn)行分裝，然后低溫貯存。

問題四：假陽性（篩選轉(zhuǎn)基因、檢測基因表達(dá)情況)第50頁,共96頁，2024年2月25日，星期天PCR反應(yīng)的類型一、錨定PCR（anchoredPCR）用于在體外擴(kuò)增未知序列的DNA片段的方法，而一般的PCR必須預(yù)先知道欲擴(kuò)增DNA片段兩側(cè)的序列，但人們經(jīng)常需要分析一段序列未知的基因片段，可利用錨定PCR。第51頁,共96頁，2024年2月25日，星期天一、錨定PCR（anchoredPCR）PCR的局限：需了解靶基因片段兩測的序列

對于未知序列和具有不同末端序列怎么辦？第52頁,共96頁，2024年2月25日，星期天該法的基本原理是在基因未知序列端添加同聚物尾，人為賦予未知基因末端序列信息，再用人工合成的與多聚尾互補(bǔ)的引物作為錨定引物，在與基因另一側(cè)配對的特異引物參與下，擴(kuò)增帶有同聚物尾的序列。錨定引物PCR對分析未知序列基因有特殊價(jià)值一、錨定PCR（anchoredPCR）第53頁,共96頁，2024年2月25日，星期天cDNA末端核酸轉(zhuǎn)移酶3’GG…GG5’CC…CC錨定引物3’GG…GG5’CC…CC3’GG…GGCC…CC第54頁,共96頁，2024年2月25日，星期天目的：擴(kuò)增產(chǎn)生特異長度的單鏈DNA在擴(kuò)增循環(huán)中引入不同引物濃度，一般用二種不同濃度的引物，50－100：1比例的引物濃度，在最初10－15個(gè)循環(huán)中主要產(chǎn)物還是雙鏈DNA，但當(dāng)?shù)蜐舛纫锉幌谋M后，高濃度引物介導(dǎo)的PCR反應(yīng)就會(huì)產(chǎn)生大量單鏈DNA。單鏈DNA可用作雜交探針或DNA測序。二、不對稱PCR（asymmetricPCR）第55頁,共96頁，2024年2月25日，星期天

高濃度引物低濃度引物第56頁,共96頁，2024年2月25日，星期天常規(guī)PCR可擴(kuò)增位于二個(gè)引物之間的DNA片段，但不能擴(kuò)增引物外側(cè)的DNA序列，反向PCR則可擴(kuò)增引物外側(cè)的DNA片段，對已知DNA片段兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增和研究。三、反向PCR（inversePCR）已知序列未知序列未知序列第57頁,共96頁，2024年2月25日，星期天已知序列未知序列未知序列限制酶連接酶限制酶第58頁,共96頁，2024年2月25日，星期天多重PCR是在同一反應(yīng)中采用多對引物同時(shí)擴(kuò)增幾個(gè)不同的DNA片段，如果基因某一區(qū)段缺失，則相應(yīng)的電泳圖譜上此區(qū)段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度減少或消失，從而發(fā)現(xiàn)基因異常。多重PCR具有靈敏快速特點(diǎn)，特別適用檢測單拷貝基因缺失、重排、插入等異常改變，其結(jié)果與Southernblotting一樣可靠，但多重PCR會(huì)檢測小片段缺失四、多重PCR（multiplexPCR）第59頁,共96頁，2024年2月25日，星期天電泳引物用于檢測特定基因序列的存在或缺失第60頁,共96頁，2024年2月25日，星期天或稱熒光PCR(fluorescentPCR)

在多重PCR試驗(yàn)中，一次試驗(yàn)還不容易區(qū)分長短相近的多種基因成分。熒光PCR可用于解決這一問題。原理：用不同的熒光染料（如紅色的羅丹明、綠色的熒光素）標(biāo)記不同的引物的5’端，同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)DNA區(qū)段，反應(yīng)完畢后，凝膠過濾除去多余的引物進(jìn)行電泳。用紫外線照射擴(kuò)增產(chǎn)物，就能顯示某一種或幾種熒光染料顏色的組合，如果某一DNA區(qū)帶缺失，則會(huì)缺乏相應(yīng)的顏色，據(jù)此可以很快診斷是否某種基因缺失，或是發(fā)現(xiàn)某些感染的病毒等。五、著色互補(bǔ)PCR（colorcomplementationPCR）第61頁,共96頁，2024年2月25日，星期天病毒1病毒2病毒3病毒4

利用同位素、熒光素等對ＰＣＲ引物進(jìn)行標(biāo)記，用以直觀地檢測目的基因。特別適合大量臨床標(biāo)本的基因診斷可同時(shí)檢測多種基因成分第62頁,共96頁，2024年2月25日，星期天標(biāo)記引物ＰＣＲ觀察第63頁,共96頁，2024年2月25日，星期天先將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后再以cDNA為模板，用PCR方法加以擴(kuò)增。應(yīng)用：①分析基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物②克隆cDNA及合成cDNA探針，改造cDNA序列等六、反轉(zhuǎn)錄PCR（reversetranscriptionPCR,RT-PCR）第64頁,共96頁，2024年2月25日，星期天RNA模板逆轉(zhuǎn)錄酶DNA-RNA雜化雙鏈RNA酶單鏈DNADNA聚合酶雙鏈DNA第65頁,共96頁，2024年2月25日，星期天基因mRNA蛋白質(zhì)多肽鏈第66頁,共96頁，2024年2月25日，星期天七、原位PCR

原位聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（InStillPCR，Is－PCR）是由Haase等于1990年首創(chuàng)。它是利用完整的細(xì)胞作為一個(gè)微小的反應(yīng)體系來擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)的目的片段，在不破壞細(xì)胞的前提下，利用一些特定的檢測手段來檢測細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)增產(chǎn)物。

直接用細(xì)胞涂片或石蠟包埋組織切片在單個(gè)細(xì)胞中進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增?？蛇M(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位。適用于檢測病理切片中含量較少的靶序列第67頁,共96頁，2024年2月25日，星期天

原位PCR的作用既往鑒定細(xì)胞內(nèi)特異序列一般采用原位雜交（ISH），但在每個(gè)細(xì)胞中目的片段的拷貝數(shù)少于10的情況下，該方法的敏感度就明顯下降。而標(biāo)準(zhǔn)的PCR則可擴(kuò)增出細(xì)胞內(nèi)單拷貝的序列，敏感度很高，但卻未能與細(xì)胞形態(tài)學(xué)研究相結(jié)合。

ISPCR則可把這兩者結(jié)合起來，成為細(xì)胞學(xué)診斷中一種嶄新的檢測技術(shù)。利用該法可檢測細(xì)胞內(nèi)病毒感染、細(xì)胞內(nèi)基因重排、以及分析細(xì)胞內(nèi)RNA表達(dá)產(chǎn)物等方面發(fā)揮一定作用。在檢測細(xì)胞的潛在感染方面也具有重要意義。第68頁,共96頁，2024年2月25日，星期天操作步驟細(xì)胞或組織的固定

PCR擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)目的片段原位雜交檢測擴(kuò)增產(chǎn)物第69頁,共96頁，2024年2月25日，星期天人類染色體端粒DNA的熒光原位雜交照片第70頁,共96頁，2024年2月25日，星期天實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)

(RealtimeQuantitativePCR)

第71頁,共96頁，2024年2月25日，星期天實(shí)時(shí)熒光定量PCR定義在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法第72頁,共96頁，2024年2月25日，星期天常規(guī)vs實(shí)時(shí)常規(guī)PCR：借助電泳對擴(kuò)增反應(yīng)的終產(chǎn)物進(jìn)行半定量及定性分析實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)：利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，最終精確的對起始模板的定量分析第73頁,共96頁，2024年2月25日，星期天優(yōu)缺點(diǎn)比較常規(guī)vs實(shí)時(shí)實(shí)時(shí)熒光定量PCR常規(guī)PCR熒光實(shí)時(shí)分析每一次循環(huán)產(chǎn)物凝膠電泳分析終產(chǎn)物精確計(jì)算初始模板濃度，靈敏度高，檢測單拷貝模板通過終產(chǎn)物定性分析模板濃度計(jì)算機(jī)自動(dòng)紀(jì)錄分析檢測方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力第74頁,共96頁，2024年2月25日，星期天優(yōu)勢來自：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及定量分析方法熒光實(shí)時(shí)監(jiān)測產(chǎn)物濃度常規(guī)vs實(shí)時(shí)第75頁,共96頁，2024年2月25日，星期天Real-timePCR的定量原理介紹四個(gè)概念：

擴(kuò)增曲線、熒光閾值、

Ct值、標(biāo)準(zhǔn)曲線第76頁,共96頁，2024年2月25日，星期天擴(kuò)增曲線圖：

橫坐標(biāo)：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)（Cycle）；

縱坐標(biāo)：熒光強(qiáng)度每個(gè)循環(huán)進(jìn)行一次熒光信號(hào)的收集熒光基團(tuán)熒光檢測元件一、擴(kuò)增曲線第77頁,共96頁，2024年2月25日，星期天熒光信號(hào)閾值（threshold）：以PCR反應(yīng)前15個(gè)循環(huán)信號(hào)作為熒光本底信號(hào)（baseline），即樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光值熒光域值定義為3～15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍真正的信號(hào):熒光信號(hào)超過域值二、熒光閾值第78頁,共96頁，2024年2月25日，星期天Ct值的定義：含義為在PCR循環(huán)過程中，熒光信號(hào)開始由本底進(jìn)入指數(shù)增長階段的拐點(diǎn)所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。實(shí)際應(yīng)用中，即每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)三、Ct值（閾值循環(huán)數(shù)）第79頁,共96頁，2024年2月25日，星期天C(t)valueCt值的確定：閾值所在的橫線與PCR擴(kuò)增曲線的交點(diǎn)所指的PCR循環(huán)次數(shù)就是CT值。第80頁,共96頁，2024年2月25日，星期天橫軸：PCR反映循環(huán)數(shù)縱軸：熒光信號(hào)量Ct值的特點(diǎn)：相同模板進(jìn)行96次擴(kuò)增，盡管平臺(tái)期DNA拷貝數(shù)波動(dòng)很大，CT值卻極具重現(xiàn)性是相對固定的。如果用不同濃度的DNA作PCR，DNA濃度越高，CT值越小。DNA濃度每增加1倍，CT值減小1個(gè)循環(huán)。CT值與模板DNA的起始拷貝數(shù)成反比。第81頁,共96頁，2024年2月25日，星期天理想的PCR反應(yīng)：

X=X0*2n非理想的PCR反應(yīng)：

X=X0(1+Ex)nn：擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)

X：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量

X0：初始模板量

Ex：擴(kuò)增效率四、Ct值與模板起始拷貝數(shù)的關(guān)系第82頁,共96頁，2024年2月25日，星期天在擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到閾值線時(shí):XCt=X0

(1+Ex)Ct=M(1)XCt:熒光擴(kuò)增信號(hào)達(dá)到閾值強(qiáng)度時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的量.在閾值線設(shè)定以后,它是一個(gè)常數(shù),我們設(shè)為M方程式(1)兩邊同時(shí)取對數(shù)得:logM=logX0

(1+Ex)Ct(2)整理方程式(2)得:logX0=-log(1+Ex)*Ct+logM(3)

Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)即Ct值就可計(jì)算出樣品中所含的模板量四、Ct值與模板起始拷貝數(shù)的關(guān)系第83頁,共96頁，2024年2月25日，星期天五、標(biāo)準(zhǔn)曲線每個(gè)模板的Ct值與模板起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系利用已知拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得未知樣品的Ct值，可從標(biāo)準(zhǔn)曲線得到模板的起始拷貝數(shù)第84頁,共96頁，2024年2月25日，星期天將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋幾個(gè)濃度，Real-timePCR后得到標(biāo)準(zhǔn)曲線確定未知樣品的C(t)值通過標(biāo)準(zhǔn)曲線由未知樣品的C(t)值推算出其初始量六、絕對定量Sample25第85頁,共96頁，2024年2月25日，星期天SYBRGreen法TaqMan法Molecularbeacon法(分子信標(biāo))Real-timePCR的幾種方法介紹第86頁,共96頁，2024年2月25日，星期天DNA產(chǎn)物的熒光標(biāo)記非特異性熒光標(biāo)記：

1、SYBRGreen特異性熒光標(biāo)記：

2、TaqMan3、MolecularBeacon

第87頁,共96頁，2024年2月25日，星期天實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法1---------SYBRGreen法SYBRGreen第88頁,共96頁，2024年2月25日，星期天一、工作原理SY