DB32T3686-2019山羊副流感病毒3型檢測(cè)技術(shù)規(guī)程

ICS65.020.30

B40DB32

江蘇省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB32/T3686—2019

山羊副流感病毒3型檢測(cè)技術(shù)規(guī)程

TechnicalregulationsfordetectionofCaprineparainfluenzavirus3

2019-12-03發(fā)布2019-12-25實(shí)施

江蘇省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布

DB32/T3686—2019

山羊副流感病毒3型檢測(cè)技術(shù)規(guī)程

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了山羊副流感病毒3型（Caprineparaifluenzavirus3,CPIV3）的病原學(xué)檢測(cè)（病毒核酸

的RT-PCR和熒光定量RT-PCR檢測(cè)）、血清學(xué)檢測(cè)（血凝抑制（HI）試驗(yàn)）的技術(shù)要求。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于山羊副流感病毒3型及其感染情況的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修訂單）適用于本文件。

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求

NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范

3病原學(xué)檢測(cè)

3.1材料

微量移液器及吸頭、DEPC水處理的離心管、吸頭、PCR擴(kuò)增管、TRIzol試劑、三氯甲烷、異丙醇、

DEPC處理水（用水符合GB/T6682規(guī)定）、反轉(zhuǎn)錄酶/TaqDNA聚合酶混合液、2×一步法RT-PCR反應(yīng)緩

沖液、一步法熒光定量RT-PCR試劑盒、TAE緩沖液、瓊脂糖、核酸染料、引物MF/MR、引物qMF/qMR

與探針（附錄A）。

3.2儀器設(shè)備

PCR儀、熒光定量PCR儀、臺(tái)式冷凍離心機(jī)、電泳儀和水平電泳槽、凝膠成相儀（或紫外透射儀）。

3.3反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）

3.3.1樣品處理與RNA的提取

采集羊的鼻拭子、氣管拭子或肺臟（樣品的采集、保存和運(yùn)輸應(yīng)符合NY/T541相關(guān)規(guī)定）。取200

μL待檢樣品液至無(wú)菌無(wú)RNA酶的EP管中，使用TRIzol試劑、RNA提取試劑盒或自動(dòng)化核酸提取儀等方

法提取RNA。

3.3.2RT-PCR反應(yīng)

RT-PCR反應(yīng)使用20μL體系：10μL2×一步法RT-PCR反應(yīng)緩沖液、引物MF/MR各0.5μL（10

μmol/L）、0.4μL反轉(zhuǎn)錄酶/TaqDNA聚合酶混合液、4μLRNA模板，4.6μLDEPC處理水。反應(yīng)條件為：

45℃反轉(zhuǎn)錄30min；94℃預(yù)變性2min；94℃30s，54℃30s，72℃30s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃延伸

10min。

3.3.3結(jié)果判定

取PCR產(chǎn)物10μL，在1.2%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果。樣品PCR檢測(cè)產(chǎn)

物電泳后有大小為346bp的片段判斷為山羊副流感病毒3型核酸陽(yáng)性，無(wú)條帶判斷為陰性。每次試驗(yàn)應(yīng)

設(shè)置陰陽(yáng)性對(duì)照，陰陽(yáng)性對(duì)照應(yīng)不出現(xiàn)或出現(xiàn)相應(yīng)大小的條帶。

1

DB32/T3686—2019

3.4熒光定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（熒光定量RT-PCR）

3.4.1核酸提取與熒光定量RT-PCR反應(yīng)

核酸提取同3.3.1。熒光定量RT-PCR反應(yīng)使用20μL體系：10μL2×一步法反應(yīng)緩沖液，0.4μL反轉(zhuǎn)

錄酶，0.4μLDNA聚合酶，引物qMF/qMR各0.4μL（10μmol/L），0.8μL探針，0.4μL染料，2μLRNA

模板，5.2μLDEPC處理水。將PCR管置于熒光定量PCR儀器上進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，程序如下：42℃5min；

95℃10s；95℃5s，60℃34s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。

3.4.2熒光定量RT-PCR結(jié)果判定

陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增曲線呈標(biāo)準(zhǔn)的S曲線，且Ct值＜30。陰性對(duì)照擴(kuò)增曲線應(yīng)為基線下的水平線。若樣本

曲線呈S形曲線，且Ct值＜38為陽(yáng)性；未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線為陰性。

4血清學(xué)檢測(cè)——血凝抑制（HI）試驗(yàn)

4.1材料

微量移液器及配套吸頭、96孔V型微量反應(yīng)板、生理鹽水、1%豚鼠紅細(xì)胞懸液（配制方法見(jiàn)附錄B）、

病毒液（相關(guān)試驗(yàn)操作應(yīng)符合GB19489的要求）、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、標(biāo)準(zhǔn)陰性血清。

4.2儀器設(shè)備

離心機(jī)、恒溫培養(yǎng)箱。

4.3病毒血凝效價(jià)測(cè)定

每次HI試驗(yàn)前應(yīng)對(duì)病毒血凝效價(jià)進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)與判定方法如下：

——在反應(yīng)板一排各孔中加25μL生理鹽水；

——第一孔中加25μL病毒分離液，按照1:2倍比稀釋，最后一孔不加抗原作陰性對(duì)照。每孔中再加

25μLPBS；

——每孔加25μL1%豚鼠紅細(xì)胞液，37℃孵育40min；

——當(dāng)紅細(xì)胞被凝集時(shí)，紅細(xì)胞均勻分布在反應(yīng)板底部，反應(yīng)板傾斜片刻，紅細(xì)胞不下滑；紅細(xì)胞

未被凝集時(shí)，反應(yīng)板傾斜片刻，可見(jiàn)沉淀的紅細(xì)胞向下滑動(dòng)，形成流線。HA效價(jià)為全部紅細(xì)

胞出現(xiàn)凝集時(shí)的最高稀釋倍數(shù)。

4.4HI試驗(yàn)

按如下方法進(jìn)行HI試驗(yàn)：

——在96孔V型微量反應(yīng)板各孔中加25μL生理鹽水；

——加25μL經(jīng)處理的血清于第一孔中，混勻后取25μL加到第2孔中，依次倍比稀釋，從第2孔

加至第11孔，第11孔混勻后吸取25μL棄去，最后1孔不加血清作為對(duì)照；

——每孔中加25μL4個(gè)HA單位的病毒抗原，37℃孵育40min；

——每孔加25μL1%豚鼠紅細(xì)胞液，37℃孵育40min。

4.5結(jié)果判定

將反應(yīng)板傾斜70度左右，若無(wú)凝集反應(yīng)，則沉淀的紅細(xì)胞向下滑動(dòng)，呈流線狀，記錄為抗體陽(yáng)性。

完全抑制凝集的抗體最高稀釋倍數(shù)為血清的HI抗體滴度。

抗體滴度大于等于16為陽(yáng)性，小于等于8為陰性。若檢測(cè)發(fā)病后雙份血清（第一份血清應(yīng)在臨床癥

狀出現(xiàn)后立即采集，第二份血清在兩周后采集），抗體滴度上升4倍或4倍以上時(shí)，表明羊只近期被感染。

2

DB32/T3686—2019

附錄A

（資料性附錄）

引物

A.1引物序列

表A.1用于RT-PCR和熒光定量RT-PCR檢測(cè)的引物、探針

引物靶基因序列（5’-3’）產(chǎn)物

MFM基因AGTGATCTAGATGATGATCCA

346bp

MRM基因GTTATTGATCCAATTGCTGT

qMFM基因GCTTGGCTTCTTTGAAATGG

150bp

qMRM基因GCCTGCAGAAGTTCCTTGTC

FAM-CAATCGGACTAGCCAAGTATGGTGG

CPIV3ProbeM基因

GA-TAMRA

A.2引物的溶解

引物MF、MR、qMF、qMR用滅菌的DEPC處理水溶解到濃度為10μmol/L；CPIV3Probe用滅菌的

DEPC處理水溶解到濃度為10μmol/L。

3

DB32/T3686—2019

附錄B

（資料性附錄）

1%豚鼠紅細(xì)胞的配制

B.1生理鹽水配制方法

氯化鈉（NaCl）0.9g

去離子水加至100mL，121℃高壓滅菌15min，冷卻后保存于2℃～8℃冰箱中備用。

B.21%豚鼠細(xì)胞懸液制備

無(wú)菌采集豚鼠血液，置于EDTA抗凝管中混勻，2℃～8℃保存。使用前吸取紅細(xì)胞懸液置離心管中，

加入生理鹽水洗滌3次，每次以2000r/min離心5min，將血漿、白細(xì)胞等充分洗去，沉積的紅細(xì)胞用生

理鹽水稀釋成1%的懸液，保存于2℃～8℃冰箱中備用。

───────────

4

DB32/T3686—2019

前言

本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。

本標(biāo)準(zhǔn)由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提出并歸口。

本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院。

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：李文良、毛立、李基棕、郝飛、劉茂軍、楊蕾蕾、孫敏。

I

DB32/T3686—2019

山羊副流感病毒3型檢測(cè)技術(shù)規(guī)程

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了山羊副流感病毒3型（Caprineparaifluenzavirus3,CPIV3）的病原學(xué)檢測(cè)（病毒核酸

的RT-PCR和熒光定量RT-PCR檢測(cè)）、血清學(xué)檢測(cè)（血凝抑制（HI）試驗(yàn)）的技術(shù)要求。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于山羊副流感病毒3型及其感染情況的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修訂單）適用于本文件。

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求

NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范

3病原學(xué)檢測(cè)

3.1材料

微量移液器及吸頭、DEPC水處理的離心管、吸頭、PCR擴(kuò)增管、TRIzol試劑、三氯甲烷、異丙醇、

DEPC處理水（用水符合GB/T6682規(guī)定）、反轉(zhuǎn)錄酶/TaqDNA聚合酶混合液、2×一步法RT-PCR反應(yīng)緩

沖液、一步法熒光定量RT-PCR試劑盒、TAE緩沖液、瓊脂糖、核酸染料、引物MF/MR、引物qMF/qMR

與探針（附錄A）。

3.2儀器設(shè)備

PCR儀、熒光定量PCR儀、臺(tái)式冷凍離心機(jī)、電泳儀和水平電泳槽、凝膠成相儀（或紫外透射儀）。

3.3反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）

3.3.1樣品處理與RNA的提取

采集羊的鼻拭子、氣管拭子或肺臟（樣品的采集、保存和運(yùn)輸應(yīng)符合NY/T541相關(guān)規(guī)定）。取200

μL待檢樣品液至無(wú)菌無(wú)RNA酶的EP管中，使用TRIzol試劑、RNA提取試劑盒或自動(dòng)化核酸提取儀等方

法提取RNA。

3.3.2RT-PCR反應(yīng)

RT-PCR反應(yīng)使用20μL體系：10μL2×一步法RT-PCR反應(yīng)緩沖液、引物MF/MR各0.5μL（10

μmol/L）、0.4μL反轉(zhuǎn)錄酶/TaqDNA聚合酶混合液、4μLRNA模板，4.6μLDEPC處理水。反應(yīng)條件為：

45℃反轉(zhuǎn)錄30min；94℃預(yù)變性2min；94℃30s，54℃30s，72℃30s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃延伸

10min。

3.3.3結(jié)果判定

取PCR產(chǎn)物10μL，在1.2%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果。樣品PCR檢測(cè)產(chǎn)

物電泳后有大小為346bp的片段判斷為山羊副流感病毒3型核酸陽(yáng)性，無(wú)條帶判斷為陰性。每次試驗(yàn)應(yīng)

設(shè)置陰陽(yáng)性對(duì)照，陰陽(yáng)性對(duì)照應(yīng)不出現(xiàn)或出現(xiàn)相應(yīng)大小的條帶。

1

DB32/T3686—2019

3.4熒光定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（熒光定量RT-PCR）

3.4.1核酸提取與熒光定量RT-PCR反應(yīng)

核酸提取同3.3.1。熒光定量RT-PCR反應(yīng)使用20μL體系：10μL2×一步法反應(yīng)緩沖液，0.4μL反轉(zhuǎn)

錄酶，0.4μLDNA聚合酶，引物qMF/qMR各0.4μL（10μmol/L），0.8μL探針，0.4μL染料，2μLRNA

模板，5.2μLDEPC處理水。將PCR管置于熒光定量PCR儀器上進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，程序如下：42℃5min；

95℃10s；95℃5s，60℃34s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。

3.4.2熒光定量RT-PCR結(jié)果判定

陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增曲線呈標(biāo)準(zhǔn)的S曲線，且Ct值＜30。陰性對(duì)照擴(kuò)增曲線應(yīng)為基線下的水平線。若樣本

曲線呈S形曲線，且Ct值＜38為陽(yáng)性；未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線為陰性。

4血清學(xué)檢測(cè)——血凝抑制（HI）試驗(yàn)

4.1材料

微量移液器及配套吸頭、96孔V型微量反應(yīng)板、生理鹽水、1%豚鼠紅細(xì)胞懸液（配制方法見(jiàn)附錄B）、

病毒液（相關(guān)試驗(yàn)操作應(yīng)符合GB19489的要求）、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、標(biāo)準(zhǔn)陰性血清。

4.2儀器設(shè)備

離心機(jī)、恒溫培養(yǎng)箱。

4.3病毒血凝效價(jià)測(cè)定

每次HI試驗(yàn)前應(yīng)對(duì)病毒血凝效價(jià)進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)與判定方法如下：

——在反應(yīng)板一排各孔中加25μL生理鹽水；

——第一孔中加25μL病毒分離液，按照1:2倍比稀釋，最后一孔不加抗原作陰性對(duì)照。每孔中再加

25μLPBS；

——每孔加25μL1%豚鼠紅細(xì)胞液，37℃孵育40min；

——當(dāng)紅細(xì)胞被凝集時(shí)，紅細(xì)胞均勻分布在反應(yīng)板底部，反應(yīng)板傾斜片刻，紅細(xì)胞不下滑；紅細(xì)胞

未被凝集時(shí)，反應(yīng)板傾斜片刻，可見(jiàn)沉淀的紅細(xì)胞向下滑動(dòng)，形成流線。HA效價(jià)為全部紅細(xì)

胞出現(xiàn)凝集時(shí)的最高稀釋倍數(shù)。

4.4HI試驗(yàn)

按如下方法進(jìn)行HI試驗(yàn)：

——在96孔V型微量反應(yīng)板各孔中加25μL生理鹽水；

——加25μL經(jīng)處理的血清于第一孔中，混勻后取25μL加到第2孔中，依次倍比稀釋，從第2孔

加至第11孔，第11孔混勻后吸取25μL棄去，最后1孔不加血清作為對(duì)照；

——每孔中加25μL4個(gè)HA單位的病毒抗原，37℃孵育40min；

——每孔加25μL1%豚鼠紅細(xì)胞液，37℃孵育40min。

4.5結(jié)果判定

將反應(yīng)板傾斜70度左右，若無(wú)凝集反應(yīng)，則沉淀的紅細(xì)胞向下滑動(dòng)，呈流線狀，記錄為抗體陽(yáng)性。

完全抑制凝集的抗體最高稀釋倍數(shù)為血清的HI抗體滴度。

抗體滴度大于等于16為陽(yáng)性，小于等于8為陰性。若檢測(cè)發(fā)病后雙份血清（第一份血清應(yīng)在臨床癥

狀出現(xiàn)后立即采集，第二份血清在兩周后采集），抗體滴度上升4倍或4倍以上時(shí)，表明羊只近期被感染。

2

DB32/T3686—2019

附錄A