天然藥物活性成分的研究

天然藥物活性成分的研究班級(jí)：生化制藥3092姓名：劉香燕前言：迄今為止，臨床應(yīng)用的藥物三分之一以上源自天然藥物。它們直接來自天然藥物或是以天然藥物活性成分為先導(dǎo)進(jìn)一步發(fā)展的衍生物、類似物或全合成產(chǎn)物。如阿司匹林，是從植物中廣泛存在的水楊酸衍生而制成的乙酰水楊酸。局部麻醉藥普魯卡因是根據(jù)植物可卡因的結(jié)構(gòu)研究得到的。我們的祖先早在17世紀(jì)初就從無頭中發(fā)現(xiàn)結(jié)晶體，但對(duì)它的系統(tǒng)研究還是歐洲化學(xué)家從19世紀(jì)開始的。19世紀(jì)初，化學(xué)家對(duì)鴉片進(jìn)行了研究，分離得到了止痛成分嗎啡與止咳成分可待因等多種生物堿。20世紀(jì)50年代，治療高血壓藥利血平與抗癌藥長(zhǎng)春新堿的發(fā)明又一次掀起天然藥物化學(xué)研究的熱潮，從而促進(jìn)了抗癌新藥紫杉醇，喜樹堿，依托泊苷及其類似物的問世。20世紀(jì)70年代，我國(guó)科學(xué)家從中藥黃花蒿中發(fā)現(xiàn)抗瘧新藥青蒿素又引起了國(guó)際對(duì)中藥研究的重視。天然藥物防治疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)是其所含的具有防治疾病作用或生物活性的化學(xué)成分即有效成分，只有明確了天然藥物的有效成分，才能為天然藥物的成產(chǎn)，加工，質(zhì)量控制，合理用藥，擴(kuò)大天然藥物資源、進(jìn)行化學(xué)合成和結(jié)構(gòu)修飾、探索天然藥物防治疾病的原理提供依據(jù)。關(guān)鍵字：研究的途徑和方法：確定目標(biāo)世界各國(guó)長(zhǎng)期以來在使用天然藥物防治疾病的過程中所積累的豐富經(jīng)驗(yàn)是尋找新藥的極為重要的源泉和基礎(chǔ)。因此，研究藥物的活性成分，首先要注意文獻(xiàn)的調(diào)研和現(xiàn)有臨床使用藥物的效果，如歷代醫(yī)書上記載中藥青蒿對(duì)“截虐”有效?；钚院Y選研究天然藥物活性成分時(shí)，首先應(yīng)選擇一種簡(jiǎn)便、快速、能反映天然藥物治療作用的藥理活性測(cè)試方法，在分離的每一階段對(duì)所得的各個(gè)組分進(jìn)行活性評(píng)價(jià)。成分預(yù)試a:單向預(yù)試即針對(duì)某一類成分而進(jìn)行的檢測(cè)，例如確證某一天然藥物中是否含有黃酮類化學(xué)成分，采用適合于黃酮類化合物的提取溶劑提取，然后用黃酮類化合物的專屬性試劑進(jìn)行定性；b：系統(tǒng)預(yù)試即先用幾種不同極性的溶劑分別對(duì)天然藥物進(jìn)行提取，再對(duì)各提取部位進(jìn)行定性推測(cè)。提取分離a：極性分離此方法是利用由小到大的各種有機(jī)溶劑對(duì)天然藥物進(jìn)行連續(xù)提取，把天然藥物中的成分分成不同的極性部位。實(shí)際操作時(shí)，常先用甲醇（或不同濃度乙醇）提取。b：?jiǎn)误w分離在部位分離的基礎(chǔ)上，可將性質(zhì)相近的成分再進(jìn)行細(xì)分，并利用各種色譜技術(shù)結(jié)合溶劑結(jié)晶法進(jìn)行單體分離。結(jié)構(gòu)測(cè)定a：純度檢查在結(jié)構(gòu)研究之前首先確定化合物的純度。若純度不合格，會(huì)給結(jié)構(gòu)測(cè)定工作帶來很大的難度，甚至導(dǎo)致結(jié)構(gòu)測(cè)定工作的失敗。b：分子式確定確定一個(gè)化合物的分子式，經(jīng)典的方法是先進(jìn)行元素的定性分析，檢查含有哪幾種元素，再測(cè)定各元素在化合物中的百分含量，從而求出化合物的實(shí)驗(yàn)式，然后根據(jù)測(cè)出的分子量，計(jì)算出該化合物的分子式。c：推測(cè)結(jié)構(gòu)化合物的分子式被確定之后，就需要進(jìn)行官能團(tuán)和分子結(jié)構(gòu)股價(jià)的確定。結(jié)構(gòu)測(cè)定中常用波譜簡(jiǎn)介紫外吸收光譜是用不同的波長(zhǎng)的紫外光為光源（波長(zhǎng)范圍200~400nm），依次照射一定濃度的試樣溶液，化合物分子因紫外線照射吸收能量而產(chǎn)生電子躍進(jìn)，在不同波長(zhǎng)下測(cè)定物質(zhì)的吸收度，并用波長(zhǎng)對(duì)吸收度或摩爾吸收系數(shù)作圖而得到的吸收光譜圖。供檢查生物堿用，附在濾紙上的殘?jiān)僖陨倭恳掖既芙猓z查黃酮和蒽醌用；另一部分浸膏以少量乙酸乙酯溶解，溶液置分液漏斗中，加適量5%NaOH振搖，使酚性物及有機(jī)酸等轉(zhuǎn)入下層氫氧化鈉水溶液中，剩下的乙酸乙酯為中性部分，用蒸餾水洗至中性，在水浴上蒸干，用乙醇溶解后供檢查香豆素、萜類內(nèi)酯用。FeCl3、溴酚綠試驗(yàn)方法參考水提液部分方法。生物堿的沉淀反應(yīng)：取4只試管，分別加入藥材醇浸膏的酸水液1ml(直接用藥材的酸水液也行)，分別加入碘化鉍鉀試劑、碘化汞鉀、硅鎢酸試劑和苦味酸試劑個(gè)1~2滴，觀察有無沉淀生成?？辔端嵩噭┡c生物堿的反應(yīng)需在中性條件或微酸性條件下進(jìn)行。若在強(qiáng)酸性條件下，苦味酸本身形成沉淀。三氯化鋁試驗(yàn)：將乙醇提取液點(diǎn)在紙片上，噴灑三氯化鋁的乙醇溶液，干燥后呈黃色斑點(diǎn)，在紫外光下觀察，呈顯著的黃色熒光，亦可能含有黃酮類。鹽酸-鎂粉反應(yīng)：取乙醇提取液1~2ml，加濃鹽酸4~5滴及少量的鎂粉，在沸水浴上加熱數(shù)分鐘，如呈現(xiàn)紅色，指示含有游離黃酮類或黃酮苷。如果被檢溶液不加鎂粉直接加濃鹽酸就能產(chǎn)生紅色，說明被檢溶液中可能含有花色素。10%KOH液試驗(yàn)：將乙醇提取液幾滴重復(fù)于濾紙片，干后噴灑10%KOH水溶液，如呈黃橙或紅色熒光，亦可能含蒽醌類。若在試管中進(jìn)行也可得到同樣的結(jié)果。取試液1ml，加入10%KOH溶液1ml，即呈紅-紅紫色，并有呈藍(lán)色者，表示可能有羥基蒽醌或其苷存在。（6）乙酸鎂試驗(yàn)：將乙醇提取液點(diǎn)在濾紙上，噴灑0.5%乙酸鎂甲醇液，如呈橙紅色或紫色（顏色隨羥基位置及數(shù)目而定），說明有蒽醌存在。若無上述顏色反應(yīng)，可將濾紙放在紫外燈下觀察熒光，若產(chǎn)生天藍(lán)色熒光，指示有二氫黃酮或二氫黃酮醇存在；若產(chǎn)生黃色或黃綠色熒光，指示有黃酮或黃酮醇類存在。（7）開環(huán)閉環(huán)反應(yīng)：將乙醇提取液1ml滴于試管中，加入1%NaOH溶液2ml，于沸水浴中加熱3~4分鐘，溶液要比未加熱之前澄清的多，加入2%鹽酸酸化后，溶液又變?yōu)闇啙?，說明有可能存在內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的化合物。但應(yīng)注意酚性化合物及有機(jī)酸的存在同樣有此現(xiàn)象，所以還要結(jié)合分析才行。（8）鹽酸羥胺反應(yīng)：取鹽酸羥胺甲醇溶液0.5ml，置于小試管中，加提取液數(shù)毫升，加2mol/LKOH甲醇溶液，使溶液呈堿性，在水浴上加熱煮沸2分鐘，冷卻后，加1%FeCl3溶液1~2滴，然后滴加5%鹽酸使溶液呈酸性，若有紫紅色呈現(xiàn)，指示為陽(yáng)性反應(yīng)。（9）哥哥-氨基安替比林-鐵氰化鉀反應(yīng)：將試液滴于濾紙上，先噴灑2%4-氨基安替比林，再噴灑8%鐵氰化鉀水溶液，即呈色，或再放入密閉缸內(nèi)，缸內(nèi)缸25%氨水，即產(chǎn)生橙紅至深紅色。3.石油醚提取液取樣品粗粉1克，加10ml石油醚（沸程60~90℃）放置2~3小時(shí)，過濾，濾液檢查揮發(fā)油、萜類、甾體類及脂肪等。（1）油斑試驗(yàn)：將石油醚提取液滴于濾紙上，在空氣中能揮發(fā)，可能為揮發(fā)油；如果出現(xiàn)持久性的透明油斑，則可能為油脂。（2）醋酐-濃硫酸反應(yīng)：取乙酸乙酯提取液1ml，置于試管中（或小蒸發(fā)皿中），用1ml冰醋酸溶解，再加1ml醋酐，最后滴加一滴濃硫酸，試管顏色逐漸由黃—>紅—>紫—>青—>污綠，指示為甾體母核的反應(yīng)，植物中含甾體母核的成分較多，如皂苷、甾醇、甾體生物堿等。（3）25%磷鉬酸乙醇溶液：石油醚溶液點(diǎn)在濾紙上，噴賽試劑后，115~118℃烘箱中放2分鐘，對(duì)油脂、三萜及甾醇（有不飽和雙鍵的）等能使試劑還原成鉬藍(lán)而呈藍(lán)色，背景為黃綠色或蘭青色。結(jié)果：在做天然藥物化學(xué)成分預(yù)實(shí)驗(yàn)前，首先須熟悉天然藥物主要結(jié)構(gòu)類型的性質(zhì)、檢識(shí)反應(yīng)，明確在天然藥物提取分離的過程中，水提液、醇提液、石油醚提取液各部分所含的化學(xué)成分，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)綜合進(jìn)行判斷。檢識(shí)反應(yīng)時(shí)，如反應(yīng)液因顏色深而難以判斷，可將反應(yīng)液用適當(dāng)溶劑稀釋后再觀察，或?qū)⒎磻?yīng)液滴在濾紙上觀察。若因成分間互相干擾，難以正確判斷檢出反應(yīng)結(jié)果時(shí)，可進(jìn)一步處理供試液，使各成分盡量分離。如反應(yīng)液中成分含量太低時(shí)，可加大供試液用量，并適當(dāng)濃縮，再做檢識(shí)反應(yīng)，必要時(shí)可做色譜檢識(shí)。試驗(yàn)的結(jié)果只能作為參考，因?yàn)橛行┓磻?yīng)為幾類成分所共有的，有時(shí)由于成分間的相互干擾結(jié)果不明顯或不正確。這可通過該成分的溶解度及層析行為給予綜合性判斷。在分析判斷可能含有的化學(xué)類型時(shí)，不能僅憑一個(gè)方面的反應(yīng)就下結(jié)論，應(yīng)結(jié)合提取分離方法等多方面進(jìn)行綜合分析。對(duì)于制劑成分的預(yù)實(shí)驗(yàn)可根據(jù)指制劑的制備工藝進(jìn)行選擇性的預(yù)實(shí)驗(yàn)，例如用水蒸氣蒸餾法制成的有效制劑，可主要進(jìn)行揮發(fā)油、內(nèi)酯等成分的預(yù)試。又例如用水煎酒精沉淀法制成的有效制劑，可不必再進(jìn)行蛋白質(zhì)、多糖成分的預(yù)試。討論:仙鶴草芽驅(qū)絳蟲成分的研究仙鶴草芽是薔薇科植物龍芽草（AgrimoniaPilosaLedeb.）根莖的芽。民間服用仙鶴草根莖芽的干粉治療絳蟲病，療效顯著；但經(jīng)臨床驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，水煎劑口服無效、醇浸后蒸去醇去渣（沉淀）服用無效，連渣服用有效。為了分離絳蟲有效成分，首先選用了臨床去絳蟲作用基本一致的體外滅囊蟲試驗(yàn)，作為尋找仙鶴草驅(qū)絳蟲有效成分的藥理指示，按圖如下進(jìn)行活性追蹤。仙鶴草干粉||石油醚||----------------------------------------------------------------------------|||||藥渣（揮去石油醚）石油醚提取物（+）||三氨甲烷提取|----------------------------------------|||||藥渣（揮去三氯甲烷）三氯甲烷提取物（—）||||----------------------------------------||