酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)

酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)

（EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay，ELISA）1酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)5/9/2024

復(fù)雜生物體系中生命物質(zhì)的化學(xué)測量是揭示生命奧秘的重要手段，在食品檢驗、疾病診斷和預(yù)防的過程中也日益凸現(xiàn)其重要作用。

經(jīng)典的化學(xué)分析方法（滴定分析、重量分析、簡單的吸光光度法）是以簡單離子或分子為檢測對象的常量或微量分析，面對生物體系成分復(fù)雜且待測物濃度較低的測試條件則往往無能為力。2酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)5/9/2024

于是，一系列針對生物體系中化學(xué)成分的測量方法應(yīng)運而生。免疫化學(xué)分析即其重要成員，它將免疫學(xué)知識與化學(xué)分析手段有機結(jié)合，為生命體系中高特異性、超微量的分析提供了解決方法。3酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)5/9/2024免疫酶技術(shù)（immunoenzymatictechnique）是繼50年代的免疫熒光（IFA）和60年代的放射免疫（RIA）分析技術(shù)之后，1971年Engvall和Perlmann又發(fā)展起來的一種新技術(shù)。是利用酶的高效催化和放大作用與特異性免疫反應(yīng)結(jié)合而建立的一種標記免疫技術(shù)。4酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)5/9/2024免疫酶技術(shù)的原理是用酶標記的抗原（或抗體）用于免疫反應(yīng)，并以相應(yīng)的底物被酶分解的顯色反應(yīng)對樣品中的抗體（或抗原）進行定位、定性和定量的分析和鑒定。5酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)5/9/2024免疫酶技術(shù)酶免疫組織化學(xué)技術(shù)(enzymeimmunohistochemicaltechnique)酶免疫測定技術(shù)(enzymeimmunoassay，EIA)均相酶免疫測定法(homogenousenzymeimmunoassay)非均相酶免疫測定法(heterogeneousenzymeimmunoassay)

是在檢測過程中抗原抗體反應(yīng)后，無需分離結(jié)合和游離酶標記物，直接根據(jù)反應(yīng)前后酶活性的改變進行待測物質(zhì)的測定的分析方法，主要用于藥物和小分子物質(zhì)的檢測，主要形式為酶放大免疫測定法(Enzymemultipliedimmunoassay)。

需經(jīng)過結(jié)合的標記物和游離的標記物的分離才能測定，分離的方法主要通過固相載體吸附后清洗未結(jié)合的游離標記物，主要形式是酶聯(lián)免疫吸附測定法(EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay，ELISA)6酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)5/9/2024

ELISA現(xiàn)在已成為目前生物技術(shù)領(lǐng)域中的前沿課題，它是一種特殊的試劑分析方法，是在免疫酶技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型的免疫測定技術(shù)。目前，該項技術(shù)已在醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)學(xué)、法醫(yī)學(xué)上得到廣泛的應(yīng)用，大多數(shù)傳染病都有ELISA檢測方法。

7酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)5/9/2024抗原抗體反應(yīng)的特異性+酶高效催化反應(yīng)的高效性2024/5/98一、ELISA基本原理和過程將抗原（抗體）固相化，與酶標記的相應(yīng)抗體（抗原）結(jié)合后，加入該酶作用的底物，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，由此進行定性或定量分析。8酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)5/9/2024ELISA基本原理ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。再加入酶標記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析。E9酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)5/9/2024Y

①固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）

Y②酶標記的抗原或抗體（標記物）③酶作用的底物（顯色劑）10酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)5/9/202411酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)5/9/2024包被：將已知抗原或抗體通過物理吸附到固相載體表面，使抗原或抗體固相化?？乖贵w反應(yīng)：先后加入被檢標本和酶結(jié)合物，使之與固相抗原或抗體發(fā)生免疫反應(yīng)而被結(jié)合固定。酶促反應(yīng)：在反應(yīng)體系中加入酶作用的底物，使發(fā)生酶促反應(yīng)而顯色。（二）ELISA基本實驗過程12酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)5/9/2024底物顯色定性或定量的分析包被反應(yīng)加入待測抗體或抗原和酶標抗原或抗體洗滌使結(jié)合在固相上的抗原抗體復(fù)合物與未結(jié)合的分離1234ELISA基本過程2024/5/91313酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)5/9/2024加樣本微量反應(yīng)孔包被好的抗體14酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)5/9/2024振蕩、洗板待測項目（抗原）15酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)5/9/2024加入酶標記的抗原V16酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)5/9/2024V酶標記物輕鏈螯合劑辣根過氧化物酶重鏈17酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)5/9/2024振蕩、洗板V18酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)5/9/2024加入底物顯色液HHHHHHHHHHHHHH19酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)5/9/202420酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)5/9/202421酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)5/9/2024三、酶聯(lián)免疫吸附試驗的特點

（一）靈敏度高（二）特異性強（三）簡便、快速（四）重復(fù)性好（五）自動化程度高，適合大批量標準化檢測（六）安全

二、ELISA的特點22酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)5/9/2024特點一：靈敏性

該測定法的靈敏度來自作為標記的酶。酶是一種有機催化劑，很少量的酶即可誘導(dǎo)大量的催化反應(yīng)，產(chǎn)生可供觀察的顯色反應(yīng)現(xiàn)象。因此該體系常被稱為酶放大體系。ELISA實現(xiàn)了在細胞或亞細胞水平上示蹤抗原或抗體的所在部位，或在微克、甚至納克水平上對其進行定量。如，在測定血清中某一物質(zhì)的含量時，化學(xué)比色法的敏感度為mg/ml水平，酶反應(yīng)測定法的敏感度約為5~10μg/ml。

23酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)5/9/2024特點二：特異性

其特異性來自抗體或抗原的選擇性?？乖贵w的結(jié)合實質(zhì)上只發(fā)生在抗原的抗原決定簇與抗體的抗原結(jié)合位點之間。由于兩者在化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型上呈互補關(guān)系，所以抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性。

例如乙肝病毒中的表面抗原（HBsAg）、e抗原（HBeAg）和核心抗體（HBcAg），雖來源于同一病毒，但僅與其相應(yīng)的抗體結(jié)合，而不與另外兩種抗體反應(yīng)。抗原抗體反應(yīng)的這種特異性使免疫測定能在一非常復(fù)雜的蛋白質(zhì)化合物（例如血清）中測定某一特定的物質(zhì)，而不需先分離待檢物。24酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)5/9/2024

酶結(jié)合物是酶與抗體或抗原,半抗原在交聯(lián)劑作用下聯(lián)結(jié)的產(chǎn)物，是ELISA成敗的關(guān)鍵試劑，它不僅具有抗體抗原特異的免疫反應(yīng)，還具有酶促反應(yīng)，顯示出生物放大作用，但不同的酶選用不同的底物，將得到不同的顏色反應(yīng)。三、酶及其底物25酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)5/9/2024酶底物顯色反應(yīng)測定波長辣根過氧化物酶(HRP)鄰苯二胺

四甲替聯(lián)苯胺

氨基水楊酸

鄰聯(lián)苯甲胺

2,2‘-連胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)銨鹽

橘紅色

黃色

棕色

蘭色

藍綠色492460449

425

642

堿性磷酸酯酶（AP）

4-硝基酚磷酸鹽(PNP)

萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽黃色

紅色400

500葡萄糖氧化酶

ABTS+HRP+葡萄糖

葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑蘭黃色

深藍色405420β-Ｄ－半乳糖苷酶

甲基傘酮基半乳糖苷(4MuG)

硝基酚半乳糖苷(ONPG)熒光

黃色

360,450

420

26酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)5/9/2024肉眼判定結(jié)果：于白色背景上直接肉眼觀察。顏色越深，反應(yīng)越強；陰性反應(yīng)為無色或極淺。根據(jù)顏色的深淺，以“＋”、“－”表示。各組各人獨立觀察記錄。測定A值：在酶標儀上，根據(jù)不同底物設(shè)定波長，以空白孔調(diào)零后測各孔OD值。以高于陰性對照孔OD值2倍為陽性。四、ELISA結(jié)果的判定27酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)5/9/2024結(jié)果的判定空白對照無顯色，而樣品顯色明顯且逐漸變淺待檢樣品孔顯色明顯空白對照28酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)5/9/2024定量方法：標準曲線待檢樣本29酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)5/9/2024

ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有3種必要的試劑：①固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）②酶標記的抗原或抗體（標記物）③酶作用的底物（顯色劑）五、ELISA的類型和操作步驟30酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)5/9/2024ELISA的類型和操作步驟（一）直接法（二）間接法（三）雙抗體夾心法（四）競爭法（五）捕獲法測IgM抗體（六）ABS-ELISA根據(jù)試劑的來源和標本的性狀以及檢測的具備條件，可設(shè)計出各種不同類型的檢測方法。31酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)5/9/2024（一）直接ELISA（檢測抗體）酶標一抗

直接法是將抗體經(jīng)過純化，再用一種易于識別的示蹤劑標記，然后使其直接與抗原結(jié)合，通過檢測抗體上的標記物來測定相應(yīng)抗原。

在直接檢測法中應(yīng)用標記的一抗可減少操作步驟，且不易出現(xiàn)背景問題，但敏感性低于間接法，而且所用的每一種抗體都必須分別進行標記。32酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)5/9/2024（二）間接法（檢測抗體）方法：用已知抗原包被，加入待測血清，再加酶標的抗抗體或二抗，加底物顯色。間接法其原理為利用酶標記的抗抗體以檢測已與固相抗原結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。優(yōu)點：其優(yōu)點在于只要變換包被抗原就可利用同一酶標抗體建立檢測相應(yīng)抗體的方法。檢測抗體最常用的方法，常用于HCV抗體、HIV抗體和梅毒螺旋體抗體等的測定。

33酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)5/9/2024間接法34酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)5/9/20242024/5/93535酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)5/9/202436酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)5/9/2024洗滌洗滌洗滌洗滌間接法測抗體-YEYYYEYEYYYEYYEYYEYYEYYEYEY+2024/5/937YHLO專業(yè)培訓(xùn)37酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)5/9/2024洗滌洗滌間接法測抗體YEYYYEYYYEYYEYYEYYEYY+38酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)5/9/2024（三）雙抗體夾心法（檢測抗原）方法：用已知抗體包被，加入待檢血清，再加酶標抗體，加底物顯色。應(yīng)用：是檢測抗原最常用的方法，此法適用于檢驗各種蛋白質(zhì)等大分子抗原（乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG）。39酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)5/9/2024雙抗體夾心法40酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)5/9/2024洗滌洗滌洗滌洗滌雙抗體夾心法測抗原+-YYYEYEYEYYEYEYEYYYYEYEYEYYYYYYYYYYYYYYYYYY2024/5/941YHLO專業(yè)培訓(xùn)41酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)5/9/2024（四）競爭法（檢測抗原、抗體）方法：用已知抗體包被，加入待測血清，再加酶標抗原，酶標抗原與待檢抗原競爭與包被抗體結(jié)合加底物顯色。

42酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)5/9/2024競爭法（檢測抗原）應(yīng)用：此法可用于抗原和半抗原的定量測定，小分子激素、藥物等ELISA測定多用此法。43酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)5/9/2024washTMB標準HBcAg標準酶標HBcAbwash待檢HBcAb

當抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢測特異性抗體；如HBeAb，HBcAb；競爭法（檢測抗體）44酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)5/9/2024洗滌洗滌競爭法測抗原+-YYYYYYEYYEYYYYEYYEYEYEYE2、加待檢物抗原與酶標抗原競爭與抗體結(jié)合3、加酶作用的底物不顯色或顯色弱3、加酶作用的底物顯色1、已知抗體包被于載體表面1、已知抗體包被于載體表面2、加酶標抗原，酶標抗原與抗體結(jié)合YE2024/5/945YHLO專業(yè)培訓(xùn)45酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)5/9/2024用已知特異性抗體包被固相載體測定管加待測抗原和一定量的酶標抗原使二者與固相抗體競爭結(jié)合對照管只加一定量酶標抗原與固相抗體直接結(jié)合分別洗滌除去未結(jié)合的成分加底物顯色分別測定兩管的吸光度值，根據(jù)對照管與測定管吸光度值之比，計算標本中待測抗原含量競爭法46酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)5/9/2024對照管由于只加酶標抗原，與固相抗體充分結(jié)合，故分解底物顯色深；測定管的顯色程度則隨待測抗原和酶標抗原與固相抗體競爭結(jié)合的結(jié)果而異。如待測抗原量多，競爭性地抑制酶標抗原與固相抗體結(jié)合，使固相上結(jié)合的酶標抗原量減少。因此，加入底物后顯色反應(yīng)較弱。競爭法47酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)5/9/2024（四）捕獲法測IgM抗體血清中針對某些抗原的特異性IgM常和非特異性IgM，以及特異性IgG同時存在，后者會干擾IgM抗體的測定，因此測定IgM抗本多用捕獲法。其原理是先用抗人IgM（μ鏈）抗體包被固相載體，使血清中所有IgM(包括特異性與非特異性IgM)均固定在固相上，經(jīng)洗滌去除IgG后，再測定特異性IgM。應(yīng)用：此方法目前主要用于檢測各類早期感染的特異性抗體IgM,如病原體急性感染診斷中的IgM型抗體、甲型肝炎HAV-IgM抗體、乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗體。48酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)5/9/2024捕獲法測IgM抗體1.將抗人IgM抗體連接在固相載體上，形成固相抗人IgM。洗滌。2.加入稀釋的血清標本：血清中的IgM抗體被固相抗體捕獲。洗滌。3.加入特異性抗原試劑：它只與固相上的特異性IgM結(jié)合。洗滌。4.加入針對特異性的酶標抗體：使之與結(jié)合在固相上的抗原反應(yīng)結(jié)合。洗滌。5.加底物顯色：如有顏色顯示，則表示血清標本中的特異性IgM抗體存在，是為陽性反應(yīng)。49酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)5/9/2024捕獲法

原理：抗人IgMμ鏈抗體包被捕獲待測標本中IgM類抗體加入特異性抗原和酶標記特異性抗原的抗體底物顯色

2024/5/95050酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)5/9/2024洗滌洗滌洗滌洗滌捕獲法原理+-EYEYEYEYEYYYYYYY

1、固相化抗人

IgMYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY1、固相化抗人

IgM2、加待測物特異性IgM與非特異性IgM和抗人IgM結(jié)合3、加特異性抗原，與特異性抗體結(jié)合4、加酶標抗體與特異性抗原結(jié)合，加底物顯色2、加待測物只有非特異性IgM和抗人IgM結(jié)合3、加特異性抗原，不能與非特異性IgM結(jié)合4、加酶標抗體無抗原結(jié)合，加底物不顯色2024/5/951YHLO專業(yè)培訓(xùn)51酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)5/9/2024（五）ABS-ELISA52酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)5/9/2024五、酶聯(lián)免疫分析技術(shù)的設(shè)備1、加樣器2、洗板機3、孵育箱4、加速儀5、酶免分析儀6、數(shù)據(jù)分析方法7、結(jié)果報告系統(tǒng)2024/5/953YHLO專業(yè)培訓(xùn)53酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)5/9/2024六、ELISA的應(yīng)用ELISA在其他領(lǐng)域測中的應(yīng)用ELISA在疾病診斷中的作用54酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)5/9/2024病原微生物及其抗體檢測如:肝炎病毒等

蛋白質(zhì)測定:各種免疫球蛋白、補體、腫瘤標記物非肽類激素測定：T3、T4，性激素測定……ELISA在疾病診斷中的作用55酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)5/9/2024

ELISA檢測“非典型肺炎”冠狀病毒

ELISA在結(jié)締組織病早期診斷中的應(yīng)用檢測抗異質(zhì)性胞核核糖蛋白A2（hnRNPA2）/類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（PtA）33抗體ELISA在疾病診斷中的作用

ELISA法檢測幽門螺桿菌抗體56酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)5/9/2024飼料中鹽酸克倫特羅的測定飼料中毒素的測定（主要包括黃曲霉毒素，簡曲霉毒素）飼料中有害微生物的快速篩檢（如沙門氏菌）甲胺磷殘留分析甲基對硫磷殘留分析呋喃丹殘留分析ELISA在飼料安全檢測中的應(yīng)用ELISA用于農(nóng)藥殘留的檢測57酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)5/9/2024河豚毒素

植物毒素如罌粟鹼、嗎啡、藻類毒素苯并芘

主要有除草劑與殺蟲劑兩大類例如殺暝松（FN）、甲氟磷酸異已酶（SOMAN）、草不綠（Alachor）、西維因（Carbaryl）、多菌靈及克菌丹（Captan）等。農(nóng)藥的檢測：58酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)5/9/2024ELISA在其他相關(guān)領(lǐng)域中的應(yīng)用科研服務(wù)食品安全……環(huán)境衛(wèi)生59酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)5/9/2024酶聯(lián)免疫分析技術(shù)的局限性

洗滌損失影響因素較多定性試驗的陰性、陽性判定值與均相方法比較，定量檢測中的準確度、精密度及線性尚欠理想。

2024/5/960YHLO專業(yè)培訓(xùn)YHLO專業(yè)培訓(xùn)60酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)5/9/2024應(yīng)用酶聯(lián)免疫分析的產(chǎn)品

據(jù)不完全統(tǒng)計，目前用