酵母菌標本片的制作

食品微生物檢驗食品微生物檢驗技術(shù)酵母菌標本片的制作教學目標知識目標1.熟悉酵母菌的形態(tài)及出芽繁殖方式2.了解酵母菌標本片的制作原理3.掌握制作酵母菌標本片的實驗步驟素質(zhì)目標技能目標1.樹立食品安全社會責任感2.強化遵紀守法的法治意識3.培養(yǎng)嚴謹細致、精益求精的工匠精神4.培養(yǎng)團結(jié)協(xié)作，愛崗敬業(yè)職業(yè)精神5.培養(yǎng)規(guī)劃思維和精益思維1.

學會區(qū)分酵母菌死活細胞的實驗方法2.協(xié)作完成酵母菌標本片的制作3.獨立設(shè)計不同酵母菌標本片制作的試驗方案酵母菌的起源談到面包，就會想到酵母，那么酵母是怎么被發(fā)現(xiàn)并使用的呢？要從公元前3000年說起，古埃及人最先掌握了制作發(fā)酵面包的技術(shù)。最初的發(fā)酵方法可能是偶然發(fā)現(xiàn)的：和好的面團在溫暖處放久了，受到空氣中野生酵母菌的侵入，導致發(fā)酵、膨脹、變酸，再經(jīng)烤制便得到了遠比“烤餅”松軟的一種新面食，這便是世界上最早的面包。也是人類對酵母最早的應(yīng)用。1680年，荷蘭人列文虎克首次用顯微鏡觀察到酵母，19世紀，法國科學家巴斯德首次發(fā)現(xiàn)釀造酒精是酵母發(fā)揮重要作用，1846年，酵母在歐洲首先實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，20世紀80年代中期，酵母在中國實現(xiàn)現(xiàn)代化生產(chǎn)。酵母菌標本片制作原理酵母菌是以出芽繁殖為主要特征的、不運動的單細胞真核微生物。其細胞核與細胞質(zhì)有明顯分化，個體大小比常見細菌大幾倍甚至十幾倍。酵母菌的形態(tài)通常有球狀、卵圓狀、橢圓狀、柱狀或香腸狀等多種。酵母菌的無性繁殖主要有芽殖，其次是裂殖與產(chǎn)生擲孢子和厚垣孢子；有性繁殖是通過接合產(chǎn)生子囊孢子。酵母菌的母細胞在一系列的芽殖后，如果長大的子細胞與母細胞并不分離，就會形成藕節(jié)狀的假菌絲。美藍是一種無毒性的染料，它的氧化型呈藍色，還原型無色。用美藍對酵母的活細胞進行染色時由于細胞的新陳代謝作用，細胞內(nèi)具有較強的還原能力，能使美藍由藍色的氧化型變?yōu)闊o色的還原型。因此，具有還原能力的酵母活細胞是無色的、而死細胞或代謝作用微弱的衰老細胞則呈藍色或淡藍色，借此即可對酵母菌的死細胞和活細胞進行鑒別。實驗材料準備1.菌種啤酒酵母、假絲酵母2.培養(yǎng)基麥芽汁瓊脂斜面試管、馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板、玉米粉蔗糖瓊脂平板、醋酸鈉瓊脂斜面試管或平板（麥氏培養(yǎng)基）3.溶液、染色劑8.5%生理鹽水、革蘭氏碘液、0.05%和0.1%美藍染色液（以pH6.0的0.02mol/L磷酸鹽緩沖液配制）、5%孔雀綠染色液、95%乙醇、0.5%沙黃染色液、0.04%或0.1%中性紅染色液（水溶)。4.儀器或其他用具接種環(huán)、酒精燈、載玻片、蓋玻片、鑷子、顯微鏡、恒溫培養(yǎng)箱啤酒酵母的形態(tài)觀察①生理鹽水浸片法：在載玻片中央加1滴無菌生理鹽水，然后按無菌操作用接種環(huán)取少量啤酒酵母菌苔與生理鹽水混勻，使其分散成云霧狀薄層，另取一清潔蓋玻片，將一邊與菌液接觸，以45°角緩慢覆蓋菌液。先用低倍鏡觀察，再用高倍鏡觀察酵母菌的形態(tài)、大小及出芽情況。啤酒酵母的形態(tài)觀察思考：1.為什么要在載玻片中央加1滴無菌生理鹽水，而不是無菌水？2.為什么要以45°角緩慢覆蓋菌液？啤酒酵母的形態(tài)觀察②水-碘液浸片法：在載玻片中央加1小滴革蘭氏染色用碘液，然后在其上加3小滴水，取少許酵母菌苔放在水一碘液中混勻，蓋上蓋玻片后鏡檢。假絲酵母的形態(tài)觀察用劃線法將假絲酵母接種在PDA瓊脂或玉米粉瓊脂培養(yǎng)基平板上，在劃線部位加無菌蓋玻片，于25-28℃培養(yǎng)3天，用無菌鑷子取下蓋玻片放于潔凈載玻片上。先用低倍鏡觀察，再用高倍鏡觀察呈樹枝狀分枝的假菌絲形態(tài)，或打開平皿蓋，在顯微鏡下直接觀察。假絲酵母剛形成的假菌絲和出芽繁殖形成的芽體不易區(qū)別，前者由細胞伸長成圓筒形，后者從其末端部或出芽連接部出芽，當生成絲狀時則較易區(qū)別。酵母菌死活細胞鑒定在載玻片中央加1滴0.1%美藍染色液，然后按無菌操作以接種環(huán)挑取少量啤酒酵母菌苔與染色液混勻，染色2~3min。另取一清潔蓋玻片，將一邊與菌液接觸，以45°角緩慢覆蓋菌液。將制片先用低倍鏡，再用高倍鏡觀察酵母菌的形態(tài)和出芽情況，區(qū)分其母細胞與芽體，區(qū)分死細胞（藍色）、活細胞（不著色）和老齡細胞（淡藍色）。染色約30min后再次進行觀察。用0.05%美藍染液重復上述操作。在一個視野里計數(shù)死細胞和活細胞，共計數(shù)5~6個視野。酵母菌死亡率一般用百分數(shù)來表示，按下列公式來計算：死亡率=死細胞總數(shù)/死活細胞總數(shù)×100%

酵母菌死活細胞鑒定取察察

酵母菌死活細胞鑒定

酵母菌子囊孢子的觀察用接種環(huán)無菌取少許菌種啤酒酵母菌種無菌操作接種在新鮮麥芽汁瓊脂斜面新鮮麥芽汁斜面25-28°培養(yǎng)24h連續(xù)轉(zhuǎn)接種3次1.菌種活化

酵母菌子囊孢子的觀察用接種環(huán)無菌取少許菌種活化酵母菌種無菌操作接種在麥氏瓊脂斜面麥氏瓊脂斜面25-28°培養(yǎng)一周2.產(chǎn)孢培養(yǎng)3染色：孔雀綠，1min5復染：0.5％沙黃，30s7鏡檢1

酵母菌子囊孢子的觀察2制片：挑取、涂片、干燥、固定4脫色:95％乙醇脫色30s6水洗結(jié)果：油鏡觀察子囊孢子呈綠色，菌體和子囊呈粉紅色3.染色與觀察酵母菌子囊孢子的觀察挑取菌種制片干燥固定染色脫色復染水洗鏡檢、結(jié)果酵母菌子囊孢子的觀察酵母菌子囊孢子的觀察討論：1.子囊孢子的形成條件是什么？2.你在實驗中是否觀察到了子囊孢子？如果沒有觀察到，試分析原因。酵母菌子囊孢子的觀察4.計算子囊形成的百分率計數(shù)時隨機取3個視野，分別計數(shù)產(chǎn)子囊孢子的子囊數(shù)和不產(chǎn)孢子的細胞，按下列公式計算：子囊形成率（%）=3個視野中形成子囊孢子數(shù)/3個視野中形成子囊與不產(chǎn)生子囊細胞總數(shù)×100%酵母菌子囊孢子的觀察5.酵母茵液泡的活體觀察：于潔凈載玻片中央加一滴中性紅染色液，取少量啤酒酵母斜面菌苔與染色液混勻，染色5min，加蓋玻片，在高倍鏡下觀察，細胞無色，液泡呈紅色。中性紅是液泡的活體染色劑，在細胞處于生活狀態(tài)時，液泡被染成