儀器分析課件第7章分子發(fā)光分析法

第7章分子發(fā)光分析法molecularluminescenceanalysis1

2分子發(fā)光分析法包括熒光分析法、磷光分析法和化學(xué)發(fā)光分析法。這三種都是通過測(cè)量被激發(fā)的分子回到基態(tài)時(shí)所發(fā)射的光輻射來進(jìn)行分析的，不同之處在于光譜產(chǎn)生的機(jī)制。分子受光子激發(fā)后，由第一電子激發(fā)單重態(tài)回到基態(tài)的任一振動(dòng)能級(jí)伴隨的光輻射稱為分子熒光。激發(fā)態(tài)分子從第一激發(fā)三重態(tài)回到基態(tài)伴隨的光輻射稱為磷光。分子受化學(xué)能激發(fā)后產(chǎn)生的發(fā)光現(xiàn)象稱為化學(xué)發(fā)光。7-1概述37-2分子熒光分析法及其基本原理分子熒光和磷光通?；?/p>

或

n形式的電子躍遷，因此都需要有不飽和官能團(tuán)的存在。在光致激發(fā)和去激發(fā)光中，價(jià)電子可以處在不同的自旋狀態(tài)，常用電子自旋狀態(tài)的多重性描述。1.電子自旋狀態(tài)的多重性一、分子熒光和磷光的產(chǎn)生4概念：?jiǎn)沃貞B(tài)（S）、基態(tài)（S0）、第一激發(fā)單重態(tài)（S1）、第二激發(fā)單重態(tài)（S2）、三重態(tài)（T）、第一激發(fā)三重態(tài)（T1）、第二激發(fā)三重態(tài)（T2）1.電子自旋狀態(tài)的多重性5熱能、電能、化學(xué)能或光能S0：基態(tài)S1、S2：第一（二）電子激發(fā)單重態(tài)T1、T2：第一（二）電子激發(fā)三重態(tài)υ：基態(tài)和激發(fā)態(tài)的振動(dòng)能級(jí)電子自旋狀態(tài)的多重性62.無輻射躍遷當(dāng)激發(fā)態(tài)分子返回基態(tài)時(shí)，如果不伴有發(fā)光現(xiàn)象，該過程稱為無輻射去激或無輻射躍遷，該過程包括振動(dòng)弛豫（VR）、內(nèi)轉(zhuǎn)換（IC）和系間竄躍（ISC）。7

電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時(shí)，通過輻射躍遷(發(fā)光)和無輻射躍遷等方式失去能量；傳遞途徑輻射躍遷熒光磷光內(nèi)轉(zhuǎn)換外轉(zhuǎn)換系間跨越振動(dòng)弛豫無輻射躍遷

激發(fā)態(tài)停留時(shí)間短、返回速度快的途徑，發(fā)生的幾率大，發(fā)光強(qiáng)度相對(duì)大；熒光：10-8～10-6s,第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)→基態(tài)；磷光：10-4～10s；第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)→基態(tài)；小結(jié)：分子熒光和磷光的產(chǎn)生8S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫能量l2l1l

3

外轉(zhuǎn)換l

2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫9熒光(磷光)：光致發(fā)光，照射光波長(zhǎng)如何選擇？熒光(磷光)的激發(fā)光譜曲線激發(fā)光譜反映了激發(fā)波長(zhǎng)與熒光強(qiáng)度之間的關(guān)系，為熒光分析選擇最佳激發(fā)波長(zhǎng)提供依據(jù)。固定測(cè)量波長(zhǎng)(選最大發(fā)射波長(zhǎng))，化合物發(fā)射的熒光(磷光)強(qiáng)度與照射光波長(zhǎng)的關(guān)系曲線。簡(jiǎn)而言之，固定發(fā)射波長(zhǎng)，找激發(fā)波長(zhǎng)。二、分子熒光分析的基本原理1.激發(fā)光譜和發(fā)射光譜10熒光(或磷光)發(fā)射光譜固定激發(fā)光波長(zhǎng)(選最大激發(fā)波長(zhǎng)),化合物發(fā)射的熒光(或磷光強(qiáng)度)與發(fā)射光波長(zhǎng)關(guān)系曲線。11激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系

（1）Stokes(斯托克斯)位移

激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長(zhǎng)差值。發(fā)射光譜的波長(zhǎng)比激發(fā)光譜的長(zhǎng)，振動(dòng)弛豫消耗了能量。

（2）熒光光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無關(guān)電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級(jí)，吸收不同波長(zhǎng)的能量(如

2

,

1)，產(chǎn)生不同吸收帶，但均回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)再躍遷回到基態(tài)，產(chǎn)生波長(zhǎng)一定的熒光(如

2′)。

（3）

鏡像規(guī)則通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜（與激發(fā)光譜形狀一樣）成鏡像對(duì)稱關(guān)系。12200250300350400450500熒光激發(fā)光譜熒光發(fā)射光譜nm蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜13

小結(jié)：什么是分子熒光發(fā)射光譜與熒光激發(fā)光譜?(1)熒光激發(fā)光譜:固定熒光發(fā)射波長(zhǎng),掃描熒光激發(fā)波長(zhǎng),所得到的激發(fā)波長(zhǎng)與熒光強(qiáng)度的一維光譜曲線。熒光發(fā)射光譜:固定熒光激發(fā)波長(zhǎng),掃描熒光發(fā)射波長(zhǎng),所得到的發(fā)射波長(zhǎng)與熒光強(qiáng)度的一維光譜曲線。

(2)熒光發(fā)射光譜是供應(yīng)能量使試樣增加能量后，針對(duì)發(fā)射的熒光所記錄的光譜,熒光激發(fā)光譜是以熒光為光源照射試樣后,針對(duì)試樣吸收能量所記錄的光譜。14思考題：簡(jiǎn)述分子熒光光譜常與其吸收光譜呈鏡像對(duì)稱關(guān)系,而又不完全對(duì)稱,且熒光光譜的波長(zhǎng)較長(zhǎng)的理由。[答](1)物質(zhì)的吸收光譜是物質(zhì)吸收光能后,由基態(tài)躍遷至較高激發(fā)態(tài)的各個(gè)振動(dòng)能級(jí)，產(chǎn)生吸收光譜的形狀是由激發(fā)態(tài)的能級(jí)分布決定的。(2)分子熒光光譜是由基態(tài)的振動(dòng)能級(jí)分布決定的。兩者情況相似,但又不相同,再加上物質(zhì)分子在激發(fā)態(tài)和基態(tài)受溶劑作用及環(huán)境的影響不同。15熒光量子產(chǎn)率（

）：是物質(zhì)熒光特性的重要參數(shù)，它反映了熒光物質(zhì)發(fā)射熒光的能力，其數(shù)值越大，說明物質(zhì)的熒光能力越強(qiáng)。在產(chǎn)生熒光的過程中，涉及到許多輻射和無輻射躍遷過程，如熒光發(fā)射、內(nèi)轉(zhuǎn)移，系間竄躍和外轉(zhuǎn)移等。很明顯，熒光的量子產(chǎn)率，與上述每一個(gè)過程的速率常數(shù)有關(guān)。如外轉(zhuǎn)換過程速度快，不出現(xiàn)熒光發(fā)射。2.熒光強(qiáng)度與溶液濃度之間的關(guān)系P12816熒光強(qiáng)度If正比于吸收的光量Ia和熒光量子效率

：

If

=

Ia

由朗-比耳定律：Ia=I0(1-10-

bc

)If=

I0(1-10-bc

)=

I0(1-e-2.3bc

)

濃度很低時(shí)，將括號(hào)項(xiàng)近似處理后：

If=2.3

I0

bc=Kc只有在極稀的溶液中，當(dāng)

bc

<0.02時(shí)才成立，對(duì)于濃度較高的溶液，由于自猝滅和自吸收等原因，使熒光強(qiáng)度和熒光物質(zhì)濃度不呈線性關(guān)系。17分子產(chǎn)生熒光必須具備兩個(gè)條件：物質(zhì)分子必須具有能吸收一定頻率紫外可見輻射的特征結(jié)構(gòu)，分子必須具有吸光的結(jié)構(gòu)吸光后被激發(fā)的分子還必須具有高的熒光量子產(chǎn)率，許多吸光物質(zhì)不一定發(fā)熒光，就是由于他們的吸光分子的熒光量子產(chǎn)率不高，而是將其吸收的能量與溶劑分子或其他溶質(zhì)分子的相互碰撞中消耗掉了，因此不能發(fā)生熒光。3.熒光的產(chǎn)生與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系18（1）共軛效應(yīng)

實(shí)驗(yàn)證明，容易實(shí)現(xiàn)

激發(fā)的芳香族化合物容易發(fā)生熒光，能發(fā)生熒光的脂肪族和脂環(huán)族化合物極少（僅少數(shù)高度共軛體系化合物除外）。任何有利于提高

電子共軛程度的結(jié)構(gòu)的改變都將提高熒光效率，并使熒光波長(zhǎng)向長(zhǎng)波方向移動(dòng)。共軛效應(yīng)使熒光增強(qiáng)的原因：主要是由于增大熒光物質(zhì)的摩爾吸光系數(shù)，有利于產(chǎn)生更多的激發(fā)態(tài)分子，從而有利于熒光的發(fā)生。19(2)剛性平面結(jié)構(gòu)

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，多數(shù)具有剛性平面結(jié)構(gòu)的有機(jī)分子具有強(qiáng)烈的熒光。因?yàn)檫@種結(jié)構(gòu)可以減少分子的振動(dòng)，使分子與溶劑或其它溶質(zhì)分子的相互作用減少，也就減少了碰撞去活的可能性。20（3）取代基效應(yīng)

芳香族化合物苯環(huán)上的不同取代基對(duì)該化合物的熒光強(qiáng)度和熒光光譜有很大的影響。

a.給電子基團(tuán)，如-OH、-OR、-CN、-NH2

、-NR2等，使熒光增強(qiáng)。因?yàn)楫a(chǎn)生了p-

共軛作用，增強(qiáng)了電子共軛程度，導(dǎo)致熒光增強(qiáng)，熒光波長(zhǎng)紅移。b.吸電子基團(tuán)，如-COOH、-NO、-CO、鹵素等，不能擴(kuò)大電子共軛程度，反而使S1-T1系間跨越增強(qiáng)，導(dǎo)致熒光減弱，磷光增強(qiáng)。21c.重原子效應(yīng)：引入質(zhì)量相對(duì)較重的原子出現(xiàn)磷光增強(qiáng)和熒光減弱的現(xiàn)象。

d.

同電子體系相互作用較小的取代基，如-SO3H、-NH3+等，對(duì)分子發(fā)光只有很小影響。因此給一個(gè)發(fā)光分子引入磺酸基可以增加分子在水溶液中的溶解度。2223（4）躍遷類型

實(shí)驗(yàn)證明，對(duì)于大多數(shù)熒光物質(zhì)，首先經(jīng)歷

或n

激發(fā)，然后經(jīng)過振動(dòng)弛豫或其他無輻射躍遷，再發(fā)生

或

n躍遷而得到熒光。在這兩種躍遷類型中，

躍遷常能發(fā)出較強(qiáng)的熒光（較大的量子產(chǎn)率）。這是由于

躍遷具有較大的摩爾吸光系數(shù)（一般比n

大100-1000倍），其次，

躍遷的壽命約為10-7-10-9s，比n

躍遷的壽命10-5-10-7s要短。此外，在

躍遷過程中，通過系間竄躍至三重態(tài)的速率常數(shù)也較?。⊿1

T1能級(jí)差較大），這也有利于熒光的發(fā)射。總之，

躍遷是產(chǎn)生熒光的主要躍遷類型。P129244.影響熒光強(qiáng)度的因素P130（1）溶劑的影響一般來說，許多共軛芳香烴化合物熒光強(qiáng)度隨溶劑極性的增加而增強(qiáng)，且熒光峰波長(zhǎng)向長(zhǎng)波方向移動(dòng)。在含有重原子的溶劑如碘乙烷和四溴化碳中，與將這些成分引入熒光物中所產(chǎn)生的重原子效應(yīng)相似，導(dǎo)致熒光減弱，磷光增強(qiáng)。若溶劑和熒光物質(zhì)形成氫鍵或溶劑使熒光物質(zhì)解離狀態(tài)改變，則熒光波長(zhǎng)和熒光強(qiáng)度也會(huì)發(fā)生改變。25（2）溫度的影響

一般來說，大多數(shù)熒光物質(zhì)的溶液隨著溫度降低，熒光效率和熒光強(qiáng)度將增加；反之，溫度升高熒光效率則下降。如熒光素的乙醇溶液在0oC以下每降低10oC，熒光效率增加3%，冷至-80oC時(shí)，熒光效率為100%。這是因?yàn)闇囟冉档蜁r(shí)，溶液中分子的活動(dòng)性減弱，溶液的黏度增大，溶質(zhì)分子與溶劑分子間碰撞機(jī)會(huì)減少，降低了各種無輻射去活化概率，使熒光效率增加，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。26（3）溶液pH的影響

帶有酸性或堿性官能團(tuán)的大多數(shù)芳香族化合物的熒光與溶液的pH有關(guān)。不同的pH值，化合物所處狀態(tài)不同，不同的化合物或化合物的分子與其離子在電子構(gòu)型上有所不同，因此，它們的熒光強(qiáng)度和熒光光譜就有一定的差別。

對(duì)于金屬離子與有機(jī)試劑形成的發(fā)光鏊合物，一方面pH會(huì)影響鏊合物的形成，另一方面還會(huì)影響鏊合物的組成，因而影響它們的熒光性質(zhì)。27（4）熒光的猝滅

熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或其它溶質(zhì)分子的相互作用引起熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象稱為熒光猝滅。能引起熒光強(qiáng)度降低的物質(zhì)稱為猝滅劑。287-3熒光分析儀器

P131光源樣品池激發(fā)單色器檢測(cè)器數(shù)據(jù)處理儀器控制發(fā)射單色器組成：激發(fā)光源、樣品池、雙單色器、檢測(cè)器。特殊點(diǎn)：兩個(gè)單色器，光源與檢測(cè)器通常成直角。29（1）激發(fā)光源

在紫外-可見區(qū)范圍，通常的光源是氙燈和高壓汞燈，此外高功率連續(xù)可調(diào)染料激光光源就是一種新型熒光激發(fā)光源。（2）樣品池

熒光用的樣品池須用低熒光的材料制成，通常用石英，形狀以方形和長(zhǎng)方形為宜。（3）單色器

光柵，激發(fā)單色器用于選擇激發(fā)波長(zhǎng)；發(fā)射單色器，用于分離出熒光發(fā)射波長(zhǎng)。（4）檢測(cè)器

由光電管和光電倍增管作檢測(cè)器，并與激發(fā)光成直角。307-4熒光分析法及其應(yīng)用由于能產(chǎn)生熒光（磷光）的化合物占被分析物的數(shù)量相當(dāng)有限的，并且許多化合物幾乎在同一波長(zhǎng)產(chǎn)生光致發(fā)光，所以熒光（磷光）法很少用于定性分析。分子發(fā)光分析法是最靈敏的分析方法之一，其靈敏度在很多情況下比紫外-可見吸收光譜法要高的多，所以更適合低濃度的分析。317-4-1定量分析方法——工作曲線法（1）校準(zhǔn)曲線法FCsFxCx（2）標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照法（比較法）如果熒光物質(zhì)的校準(zhǔn)曲線通過零點(diǎn)，就可以選擇其線性范圍內(nèi)某一濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照法測(cè)定。327-4-2應(yīng)用1.無機(jī)化合物的分析

很多無機(jī)離子能與一些有機(jī)試劑形成熒光絡(luò)合物而被測(cè)定，這種試劑稱為熒光試劑，這種方法稱為直接熒光法。還有一些無機(jī)離子，它們不能形成熒光絡(luò)合物，但能使其他物質(zhì)的熒光減弱，可利用熒光猝滅法測(cè)定。（1）直接熒光法：鈹、鋁、硼、鎵、硒、鎂、稀土（2）熒光猝滅法：氟、硫、鐵、銀、鈷、鎳332.有機(jī)化合物的分析此外，藥物中的胺類、甾族類、抗生素、維生素、氨基酸、蛋白質(zhì)和酶等大多具有熒光，可用熒光法測(cè)定。34357-5化學(xué)發(fā)光分析法（自學(xué)）化學(xué)發(fā)光是由化學(xué)反應(yīng)提供的能量激發(fā)物質(zhì)產(chǎn)生的光輻射。發(fā)生于生物體的化學(xué)發(fā)光，稱為生物發(fā)光。利用化學(xué)發(fā)光而建立起來的方法，稱為化學(xué)發(fā)光分析法。367-5-1化學(xué)發(fā)光分析法的基本原理1.化學(xué)發(fā)光分析法的基本原理化學(xué)發(fā)光是吸收化學(xué)反應(yīng)過程產(chǎn)生的化學(xué)能，而使反應(yīng)產(chǎn)物分子激發(fā)所發(fā)射的光。任何一個(gè)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)都應(yīng)包括化學(xué)激發(fā)和發(fā)光兩個(gè)步驟?；瘜W(xué)發(fā)光反應(yīng)效率

CL，又稱化學(xué)發(fā)光的總量子產(chǎn)率。它決定于生成激發(fā)態(tài)產(chǎn)物分子的化學(xué)激發(fā)效率

CE和激發(fā)態(tài)分子的發(fā)射效率

EM。定義為：

CL=發(fā)射光子的分子數(shù)/參加反應(yīng)的分子數(shù)=

CE

EMAP*P+hv激活發(fā)光37化學(xué)發(fā)光必須滿足如下條件：（1）化學(xué)反應(yīng)必須提供足夠的激發(fā)能，激發(fā)能主要來源于反應(yīng)焓。（2）要有有利的化學(xué)反應(yīng)歷程，使化學(xué)反應(yīng)的能量至少能被一種物質(zhì)所接受并生成激發(fā)態(tài)。（3）要觀察到化學(xué)發(fā)光，激發(fā)態(tài)能釋放光子或能夠轉(zhuǎn)移它的能量給另一個(gè)分子，而使該分子激發(fā)，然后以輻射光子的形式回到基態(tài)。（4）由于化學(xué)激活的瞬時(shí)性，激活能必須由某一步驟單獨(dú)提供，否則，前一步反應(yīng)所釋放出的能量將會(huì)因分子振動(dòng)而被消耗掉。38

化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的發(fā)光強(qiáng)度IcL以單位時(shí)間內(nèi)發(fā)射的光子數(shù)表示。它等于化學(xué)發(fā)光效率

CL與單位時(shí)間內(nèi)起了反應(yīng)的被測(cè)反應(yīng)物A濃度的變化的乘積，即

ICL(t)=

CL

dcA/dt

式中ICL(t)表示t時(shí)刻的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，

CL是與分析物有關(guān)的化學(xué)發(fā)光效率dcA/dt是分析物參加反應(yīng)的速率。2.化學(xué)發(fā)光的強(qiáng)度397-5-2

化學(xué)發(fā)光的類型1.直接化學(xué)發(fā)光和間接化學(xué)發(fā)光直接發(fā)光是被測(cè)物作為反應(yīng)物直接參加化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，生成電子激發(fā)態(tài)產(chǎn)物分子，此初始激發(fā)態(tài)能輻射光子。

A+B

C*+DC*

C+h

式中A或B是被測(cè)物，通過反應(yīng)生成電子激發(fā)態(tài)產(chǎn)物C*，當(dāng)C*躍遷回基態(tài)時(shí)，輻射光子40間接發(fā)光是被測(cè)物A或B，通過化學(xué)反應(yīng)生成初始激發(fā)態(tài)產(chǎn)物C*，C*不直接發(fā)光，而是將其能量轉(zhuǎn)移給F，使F躍遷回基態(tài)，產(chǎn)生發(fā)光。

A+B

C*+DC*+F

F*+EF*

F+h

式中C*為能量給予體，而F為能量接受體。412.氣相化學(xué)發(fā)光

主要有O3、NO、S的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，可用于監(jiān)測(cè)空氣中的O3、NO、SO2、H2S、CO、NO2等。（1）臭氧的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)（2）氮氧化物的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)（3）利用氧原子的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)423.液相化學(xué)發(fā)光用于此類化學(xué)發(fā)光分析的發(fā)光物質(zhì)有魯米諾、光澤堿、洛粉堿等。例如，利用發(fā)光物質(zhì)魯米諾，可測(cè)定痕量的H2O2以及Cu、Mn、Co、V、Fe、Cr、Ce等金屬離子437-5-3化學(xué)發(fā)光的測(cè)量?jī)x器化學(xué)發(fā)光分析法的測(cè)量?jī)x器主要包括樣品室、光檢測(cè)器、放大器和信號(hào)輸出裝置?；瘜W(xué)發(fā)光反應(yīng)在樣品室中進(jìn)行，樣品和試劑混合的方式有不連續(xù)取樣體系，加樣是間歇的。將試劑先加到光電倍增管前面的反應(yīng)池內(nèi)，然后用進(jìn)樣器加入分析物。另一種方法是連續(xù)流動(dòng)體系，反應(yīng)試劑和分析物是定時(shí)在樣品池中匯合反應(yīng)，且在載流推動(dòng)下向前移動(dòng)，被檢測(cè)的光信號(hào)只是整個(gè)發(fā)光動(dòng)力學(xué)曲線的一部分，而以峰高進(jìn)行定量測(cè)量。447-5-4化學(xué)發(fā)光分析法的特點(diǎn)及應(yīng)用化學(xué)發(fā)光最顯著的特點(diǎn)是：靈敏度高，其檢出限可達(dá)10-15mol/L線性范圍寬，一般可達(dá)4-5個(gè)數(shù)量級(jí)操作簡(jiǎn)單，易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化所用儀器設(shè)備簡(jiǎn)單，不需要光源和單色器，無光散射及雜散光引起背景值的干擾應(yīng)用：表7-6和表7-745補(bǔ)充：磷光分析法磷光和熒光都是光致發(fā)光，任何發(fā)射磷光的物質(zhì)也都具有兩個(gè)特征光譜，即磷光激發(fā)光譜和磷光發(fā)射光譜。其定量分析的依據(jù)是在一定條件下磷光強(qiáng)度與磷光物質(zhì)濃度成正