第五講 DNA的復(fù)制課件

分子生物學(xué)第五講DNA的復(fù)制ThereplicationofDNA第五講DNA的復(fù)制第五講DNA的復(fù)制

一、DNA的復(fù)制二、RNA的反轉(zhuǎn)錄三、DNA的轉(zhuǎn)座第五講DNA的復(fù)制

脫氧核糖核酸（DNA）是生物界遺傳的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。生物有機體的遺傳特征以密碼的形式編碼在DNA分子上，表現(xiàn)為特定的核苷酸排列順序－即遺傳信息。在細胞分裂前通過DNA的復(fù)制，將遺傳信息由親代傳遞給子代。在后代的個體發(fā)育過程中，遺傳信息自DNA轉(zhuǎn)錄給RNA，并指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成，以執(zhí)行各種生命功能。使后代表現(xiàn)出與親代相似的遺傳性狀，這種遺傳信息的傳遞方向，是從DNA到RNA再到蛋白質(zhì)，即所謂的生物學(xué)“中心法則”。80年代以后，在某些致癌RNA病毒中發(fā)現(xiàn)遺傳信息也存在于RNA分子中，由RNA通過逆轉(zhuǎn)錄的方式將遺傳信息傳遞給DNA。這個中心法則加入了新的內(nèi)容。這也就是我們前面提到過的，目前被生物界認可的遺傳信息傳遞的中心法則。

第五講DNA的復(fù)制

復(fù)制轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄翻譯DNARNAPRO生理功能遺傳信息傳遞的中心法則第五講DNA的復(fù)制第五講DNA的復(fù)制（一）、DNA的復(fù)制（二）、復(fù)制的起始階段（三）、DNA復(fù)制的延長階段以及參與的酶和蛋白質(zhì)分子

（四）、DNA復(fù)制的終止階段（五）、復(fù)制的幾種主要方式（六）、真核生物復(fù)制第五講DNA的復(fù)制DNA復(fù)制（theReplicationofDNA

）親代雙鏈DNA分子在DNA聚合酶的作用下，分別以每單鏈DNA分子為模板，聚合與自身堿基可以互補配對的游離的dNTP,合成出兩條與親代DNA分子完全相同的子代DNA分子的過程。

第五講DNA的復(fù)制（一）、DNA的復(fù)制

1、DNA半保留復(fù)制的機理2、DNA的半不連續(xù)復(fù)制

第五講DNA的復(fù)制1、DNA半保留復(fù)制的機理

Semi-Conservation

ReplicationDNA作為遺傳物質(zhì)的基本特點就是在細胞分裂前進行準(zhǔn)確的自我復(fù)制，使DNA的量成倍增加，這是細胞分裂的物質(zhì)基礎(chǔ)。1953年Watson和Crick提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，模型指出，DNA分子由兩條多核苷酸鏈組成，兩條鏈的堿基配對規(guī)則：G只能與C配對，A只能與T配對，以氫鍵相連，所以兩條鏈?zhǔn)腔パa的，一條鏈上的核苷酸排列順序決定了另一條鏈上的核苷酸排列順序。就是說，DNA分子的每一條鏈都含有合成它的互補鏈所需的全部信息。

第五講DNA的復(fù)制這就說明DNA的復(fù)制是由原來存在的分子為模板來合成新的鏈。曾經(jīng)有許多關(guān)于DNA復(fù)制方式的學(xué)說，包括半保留復(fù)制，全保留復(fù)制以及分散復(fù)制等。Watson和Crick在提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型時就推測，DNA在復(fù)制時首先兩條鏈之間的氫鍵斷裂開，然后以每一條鏈分別做模板各自合成一條新的DNA鏈，這樣新合成的子代DNA分子中一條鏈來自親代DNA，另一條鏈?zhǔn)切潞铣傻?，這種復(fù)制方式為半保留復(fù)制。第五講DNA的復(fù)制Threereplicationhypotheses第五講DNA的復(fù)制1958年Maselson和Stahl利用氮標(biāo)記技術(shù)在大腸桿菌中首次證實了DNA的半保留復(fù)制。他們將大腸桿菌放在含有N15標(biāo)記的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到N15－DNA。然后將細菌轉(zhuǎn)移到含有N14標(biāo)記的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，在培養(yǎng)不同代數(shù)時，收集細菌，裂解細胞，用氯化銫密度梯度離心法觀察DNA所處的位置。由于N15標(biāo)記的DNA的密度比普通DNA的密度大，在氯化銫密度梯度離心時，兩種密度不同的DNA分布在不同的區(qū)帶。

第五講DNA的復(fù)制

實驗結(jié)果表明：在全部由N15標(biāo)記的培養(yǎng)基中得到的N15－DNA顯示為一條重密度帶，位于離心管的管底。當(dāng)轉(zhuǎn)入N14標(biāo)記的培養(yǎng)基中繁殖后第一代，得到了一條中密度帶，這是N15－DNA和N14－DNA的雜交分子。第二代有中密度帶及低密度帶兩個區(qū)帶，這表明它們分別為N14－DNA分子

和N14－N15－DNA雜合分子。隨著以后在N14培養(yǎng)基中培養(yǎng)代數(shù)的增加，低密度帶增強，而中密度帶逐漸減弱，離心結(jié)束從管底到管口，CsCL溶液密度，不同重量的DNA分子就停留在于其相當(dāng)?shù)腃sCL密度處，在紫外光可以看到DNA分子形成的區(qū)帶。第五講DNA的復(fù)制為了證實第一代雜交分子確實是一半N15－DNA一半N14－DNA：將這種雜交分子經(jīng)加熱變性，對于變性前后的DNA分別進行CsCL密度梯度離心。結(jié)果變性前的雜交分子為一條中密度帶，變性后則分為兩條區(qū)帶，即重密度帶（N15－DNA）和低密度帶（N14－DNA）。它們的實驗只有用半保留復(fù)制的理論才能得到圓滿的解釋。

第五講DNA的復(fù)制(CsClgradientcentrifuge)

N15

N14DNASemi-ConservationReplicationM.MeselsonandF.W.Stahl,Sciences44:675,1958.第五講DNA的復(fù)制1、DNA半保留復(fù)制的證據(jù)第五講DNA的復(fù)制

模板：能提供合成一條互補鏈所需要精確信息的核酸鏈。

第五講DNA的復(fù)制2、DNA的半不連續(xù)復(fù)制

（semi-discontinuouseplication）

在體內(nèi)，DNA的兩條鏈都能作為模板，同時合成出兩條新的互補鏈。由于DNA分子的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械?，一條鏈的走向為5'－3'，另一條鏈為3'－5'。但是所有已知DNA聚合酶的合成方向都是5'－3'，而不是3'－5'。這就很難說明，DNA在復(fù)制時，兩條鏈如何能夠同時作為模板合成其互補鏈。為了解釋這一現(xiàn)象，日本學(xué)者崗崎提出了半不連續(xù)復(fù)制模型。。

第五講DNA的復(fù)制3‘5‘3‘5‘OK!How?5‘3‘5‘3‘第五講DNA的復(fù)制1968年，崗崎用3H－脫氧胸苷短時間標(biāo)記大腸桿菌，提取DNA，變性后用超離心法得到了許多3H標(biāo)記的，后人稱為崗崎片斷的DNA。延長標(biāo)記時間后，崗崎片度可轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓腄NA鏈，因此，這些片斷必然是復(fù)制過程的中間產(chǎn)物。第五講DNA的復(fù)制但是岡崎等最初不能確定DNA鏈的不連續(xù)只發(fā)生在一條鏈上還是兩條鏈都如此。對崗崎片斷進行測定，結(jié)果測得的數(shù)據(jù)遠超過新合成DNA的一半，似乎兩條鏈都是不連續(xù)的。后來發(fā)現(xiàn)，這是由于尿嘧啶代替胸腺嘧啶摻入DNA造成的。DNA中的尿嘧啶可被尿嘧啶－DNA-糖苷酶切除，隨后該處的磷酸二脂鍵斷裂，一些核苷酸被水解，造成一個缺口，最后缺口空隙被填補和修復(fù)，在此過程中也會產(chǎn)生一些類似崗崎片斷的DNA片斷。第五講DNA的復(fù)制dUTP:dTTP=1：300incell

---A-------T--------G--------C----AUGUdutgenedUTPase少數(shù)dUTP

DNA中不能有U?---A-------T----突變頻率=1/1200！？---A------A---

---U---------Ungase

ungU尿嘧啶-N-糖基酶第五講DNA的復(fù)制UUdenaturedumpfragment~1200base~Okazakifragment●

ung–dumpfragmentlonger●dut

–

dumpfragmentshorterAA第五講DNA的復(fù)制當(dāng)用缺乏糖苷酶的大腸桿菌變異株（ung-進行實驗時，尿嘧啶不再被切除。）此時，新合成的DNA有一半放射性標(biāo)記出現(xiàn)于崗崎片斷中，另一股直接進入大的片斷。由此可見，當(dāng)DNA復(fù)制時，一條鏈?zhǔn)沁B續(xù)的，另一條鏈?zhǔn)遣贿B續(xù)的，因此稱為半不連續(xù)復(fù)制（semi-discontinuousreplication）

。第五講DNA的復(fù)制前導(dǎo)鏈(leadingstrand)：以復(fù)制叉向前移動的方向為標(biāo)準(zhǔn)，一條模板鏈?zhǔn)?‘－5’走向，在其上DNA能以5‘－3’方向連續(xù)合成，稱為前導(dǎo)鏈。

滯后鏈(laggingstrand)：另一條模板鏈?zhǔn)?‘－3’走向，在其上DNA也是從5‘－3’方向合成，但是與復(fù)制叉移動的方向相反，所以隨著復(fù)制叉的移動，形成許多不連續(xù)的片斷，最后完成一條完整的DNA鏈，這條鏈稱為滯后鏈。第五講DNA的復(fù)制DNA的半不連續(xù)復(fù)制第五講DNA的復(fù)制DNA復(fù)制的過程可以人為地劃分成3個階段:第一階段為DNA復(fù)制的起始階段，這個階段包括起始點，復(fù)制方向以及引發(fā)體的形成；第二階段為DNA鏈的延長，包括前導(dǎo)鏈及隨從鏈的形成和切除RNA引物后填補空缺及連接岡崎片段；第三階段為DNA復(fù)制的終止階段。DNA復(fù)制的整個過程中需要30多種酶及蛋白質(zhì)分子參加，我們將在DNA復(fù)制的各個階段著重介紹它們的作用。第五講DNA的復(fù)制第五講DNA的復(fù)制（二）、復(fù)制的起始階段

1、復(fù)制的起點2、復(fù)制的方向3、復(fù)制的速度

4、DNA復(fù)制起始引發(fā)體的形成及所參與的酶和蛋白質(zhì)

第五講DNA的復(fù)制1、復(fù)制的起點

（originofreplication）很多實驗都表明：復(fù)制是從DNA分子上的特定部位開始的，這一部位叫做復(fù)制起始點常用ori或o表示。細胞中的DNA復(fù)制一經(jīng)開始就會連續(xù)復(fù)制下去，直至完成細胞中全部基因組DNA的復(fù)制。復(fù)制子（Thereplicon

）：DNA復(fù)制從起始點開始直到終點為止，每個這樣的DNA單位稱為復(fù)制子或復(fù)制單元。第五講DNA的復(fù)制在原核生物中，每個DNA分子只有一個復(fù)制起點，因而只有一個復(fù)制子。而在真核生物中，DNA的復(fù)制是從許多起始點同時開始的，所以每個DNA分子上有許多個復(fù)制子。第五講DNA的復(fù)制DNA復(fù)制起始點有結(jié)構(gòu)上的特殊性。例如：大腸桿菌染色體DNA復(fù)制起始點Oric由422個核苷酸組成，其中有9個核苷酸或13個核苷酸組成的保守序列，這些部位是大腸桿菌中DnaA蛋白識別的位置，大腸桿菌染色體DNA是環(huán)狀雙鏈DNA。DNA是環(huán)狀雙鏈DNA，它的復(fù)制是典型的θ型復(fù)制。從一個起點開始，同時向兩個方向進行復(fù)制，當(dāng)兩個復(fù)制方向相遇時，復(fù)制就停止。第五講DNA的復(fù)制二、復(fù)制的起始階段第五講DNA的復(fù)制

復(fù)制叉（replicationfork）：DNA分子中正在進行復(fù)制的分叉部位。它由兩條親代鏈及在其上新合成的子鏈構(gòu)成。大多數(shù)生物體內(nèi)DNA的復(fù)制都是從復(fù)制起點開始以雙向等速形式進行。少數(shù)為雙向不等速或單向方式進行復(fù)制。第五講DNA的復(fù)制復(fù)制叉第五講DNA的復(fù)制2、復(fù)制的方向（1）、定點開始雙向復(fù)制（2）、定點開始單向復(fù)制（3）、兩點開始單向復(fù)制第五講DNA的復(fù)制（1）、定點開始雙向復(fù)制這是原核生物和真核生物DNA復(fù)制最主要的形式，從一個特定位點解鏈，沿著兩個相反的方向各生長出兩條鏈。第五講DNA的復(fù)制1、復(fù)制子第五講DNA的復(fù)制（2）、定點開始單向復(fù)制質(zhì)粒colE1是個典型的例子，復(fù)制從一個起始點開始，以同一方向生長出兩條鏈，形成一個復(fù)制叉。第五講DNA的復(fù)制（3）、兩點開始單向復(fù)制第五講DNA的復(fù)制（3）、兩點開始單向復(fù)制

腺病毒DNA的復(fù)制是從2個起點開始的，形成2個復(fù)制叉，各以一個單一方向復(fù)制出一條新鏈。第五講DNA的復(fù)制（3）、兩點開始單向復(fù)制第五講DNA的復(fù)制（3）、兩點開始單向復(fù)制第五講DNA的復(fù)制3、復(fù)制的速度有雙向等速的，也有雙向不等速的。第五講DNA的復(fù)制4、DNA復(fù)制起始引發(fā)體的

形成及所參與的酶和蛋白質(zhì)

（1）、DNA雙螺旋解旋（2）、引發(fā)體的形成

第五講DNA的復(fù)制（1）、DNA雙螺旋解旋

DNA在復(fù)制時，其雙鏈?zhǔn)紫冉忾_，形成復(fù)制叉?，F(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些酶和蛋白質(zhì)能使DNA雙鏈變得易于解開，或者可以使超螺旋分子松弛。1）、單鏈結(jié)合蛋白（SSB）

2）、

DNA解鏈酶（DNAhelicase）

3）、DNA的解鏈過程

第五講DNA的復(fù)制單鏈結(jié)合蛋白（SSB）

其作用是保證解鏈酶解開的單鏈在復(fù)制完成前保持單鏈結(jié)構(gòu)，它以四聚體形式存在于復(fù)制叉處，待單鏈復(fù)制后才掉下，重新循環(huán).第五講DNA的復(fù)制DNA解鏈酶（DNAhelicase）DNA解鏈酶能通過水解ATP獲得能量來解開雙鏈DNA。它分解ATP的活性依賴于單鏈DNA的存在。如果雙鏈DNA中有單鏈末端或切口，則DNA解鏈酶可以首先結(jié)合在這一部分，然后逐步向雙鏈方向移動。大部分DNA解鏈酶可沿滯后鏈模板的5’－3’方向并隨著復(fù)制叉的前進而移動，只有另一種解鏈酶（Rep蛋白）是沿著前導(dǎo)鏈模板的3’－5’方向移動。因此推測Rep蛋白和特定DNA解鏈酶分別在DNA的兩條鏈上協(xié)同作用，解開雙鏈DNA。

第五講DNA的復(fù)制DNAhelicases第五講DNA的復(fù)制DNA的解鏈過程

DNA在未復(fù)制前處于超螺旋結(jié)構(gòu)，首先在拓撲異構(gòu)酶的作用下解開負超螺旋，并與解鏈酶共同作用，在復(fù)制起點處解開雙鏈。在解鏈過程中除了解鏈酶，還有一些特異蛋白，如DnaA，一旦局部解開雙鏈，就必需有SSB蛋白來穩(wěn)定解開的單鏈，以保證局部不會恢復(fù)成雙鏈。接著由引發(fā)酶等組成的引發(fā)體會馬上作用于兩條單鏈DNA。不論前導(dǎo)鏈還是滯后鏈都需要一段RNA引物以開始子鏈DNA的合成。第五講DNA的復(fù)制（2）、引發(fā)體（primosome）的形成DNA復(fù)制起始的關(guān)鍵步驟是前導(dǎo)鏈DNA的合成，一旦前導(dǎo)鏈DNA的聚合作用開始，隨從鏈DNA的合成也隨著開始。由于前導(dǎo)鏈的合成是連續(xù)進行的，所以它的起始只要有一段RNA引物，DNA聚合酶就能以此為起點，一直合成下去，相對簡單。而隨從鏈的合成是不連續(xù)進行的，所以引發(fā)階段比較復(fù)雜。大腸桿菌的引發(fā)前體由DnaB、DnaC和單鏈結(jié)合蛋白組成。第五講DNA的復(fù)制（2）、引發(fā)體的形成1）、引物酶2）、引發(fā)體第五講DNA的復(fù)制引物酶（primase）它是一種特殊的RNA聚合酶，可催化短片段RNA的合成，即引物的合成。引物：是短RNA片段，一般十幾個至數(shù)十個核苷酸不等，它能與單鏈DNA配對，并且提供了一個自由的3’－OH末端，該末端提供了由DNA聚合酶催化形成DNA分子第一個磷酸二脂鍵的位置。第五講DNA的復(fù)制DNA聚合酶需要一個3－OH末端以起始復(fù)制（primase）第五講DNA的復(fù)制引發(fā)體引發(fā)體由6種蛋白質(zhì)n,n’,n’’,DnaB、C和I共同組成，只有這6種蛋白質(zhì)結(jié)合在一起并與引發(fā)酶進一步組裝成引發(fā)體才能發(fā)揮其功效。引發(fā)體像火車頭一樣在滯后鏈分叉的方向上漿進，并在模板上斷斷續(xù)續(xù)的引發(fā)生成滯后鏈的引物RNA短鏈，再由DNA聚合酶三作用合成DNA，直至遇到下一個引物或崗崎片斷為止。第五講DNA的復(fù)制Primosome（consistsofsixproteins）

PriA(dualrole)displaceSSBfromS.SDNAandhelicase

DnaT

requiredatpreprimingstage

DnaBiscentralcomponent,actionwithDnaC

DnaC

iscentralcomponent,actionwithDnaBPriB

functionisunknown

PriC

functionisunknownDnaGprimase第五講DNA的復(fù)制第五講DNA的復(fù)制replisome第五講DNA的復(fù)制（2）、引發(fā)體的形成第五講DNA的復(fù)制（三）、DNA復(fù)制的延長

階段以及參與的酶和蛋白質(zhì)分子

1、DNA聚合反應(yīng)和DNA酶2、與超螺旋松馳有關(guān)的酶：第五講DNA的復(fù)制DNA的復(fù)制DNA的復(fù)制實際上就是以DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下，將有力的四種脫氧單核苷酸（dATP，dGTP，dCTP，dTTP，簡寫為dNTP）聚合成DNA的過程。這是一個非常復(fù)雜的酶促反應(yīng)，需要許多酶和蛋白質(zhì)參與，現(xiàn)在分別敘述它們在DNA復(fù)制中作用。第五講DNA的復(fù)制SubstratesrequiredforDNAsynthesis第五講DNA的復(fù)制+n1dATPn4dTTPn3dCTP+n2dGTP++DNA+Mg2+DNA聚合酶DNAdAMPdTMPdCMPdGMP(n1+n2+n3+n4)PPi第五講DNA的復(fù)制1、DNA聚合反應(yīng)和DNA酶1957年，Arthurkornberg首次在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)DNA聚合酶I，簡寫為DNApolI。后來又相繼發(fā)現(xiàn)了DNA聚合酶II和DNA聚合酶III。實驗證明大腸桿菌中DNA復(fù)制的主要過程靠DNApolIII，而DNApolI和

DNApolII在DNA錯配的修正和修復(fù)中起作用。第五講DNA的復(fù)制這種酶的共同性質(zhì)是：

①需要DNA模板，因此這類酶又稱為依賴DNA的DNA聚合酶。②需要RNA或DNA作為引物，即DNA聚合酶不能從頭催化DNA的起始。③催化dNTP加到生長中的DNA鏈的3‘-OH末端，因而DNA的合成方向是5’－3’④三種DNA聚合酶都是多功能酶，它們在DNA復(fù)制和修復(fù)過程的不同階段發(fā)揮作用。第五講DNA的復(fù)制1、DNA聚合反應(yīng)和DNA酶（1）、原核生物DNA聚合酶（2）、真核生物DNA聚合酶第五講DNA的復(fù)制（1）、原核生物DNA聚合酶1）、DNA合酶I2）、DNA合酶Ⅱ3）、DNA合酶Ⅲ第五講DNA的復(fù)制1）、DNA合酶I

DNApolI是由一條多肽鏈組成，分子量為109KD。酶分子中含有一個Zn2＋，是聚合活性必須的。A、DNA聚合酶的5’－3’聚合活性

B、DNA聚合酶的3‘→5’外切酶活性──校對作用

C、DNA聚合酶的5'→3'外切酶活性──切除修復(fù)作用第五講DNA的復(fù)制第五講DNA的復(fù)制A、DNA聚合酶的5’－3’聚合活性

這是DNA聚合酶最主要的活性，在引物RNA3‘-OH末端，以dNTP為底物，按模板DNA上的指令由DNApolⅠ逐個將核苷酸加上去，就是DNApolⅠ的聚合作用。酶的專一性主要表現(xiàn)為新進入的脫氧核苷酸必須與模板DNA配對時才有催化作用。dNTP進入結(jié)合位點后，可能使酶的構(gòu)象發(fā)生變化，促進3‘-OH與5’-PO4結(jié)合生成磷酸二酯鍵。若是錯誤的核苷酸進入結(jié)合位點，則不能與模板配對，無法改變酶的構(gòu)象而被3'-5'外切酶活性位點所識別并切除之。第五講DNA的復(fù)制1）、DNA合酶I

第五講DNA的復(fù)制B、DNA聚合酶的3‘→5’外切酶活性──校對作用

這種酶活性的主要功能是從3‘→5’方向識別和切除不配對的DNA生長鏈末端的核苷酸。這種功能稱為校對功能，這是保證聚合作用的正確性不可缺少的，因此，對于DNA復(fù)制中極高的保真性至關(guān)重要。第五講DNA的復(fù)制1）、DNA合酶I

第五講DNA的復(fù)制第五講DNA的復(fù)制C、DNA聚合酶的5‘→3’外切酶活性──切除修復(fù)作用5‘→3’外切酶活性就是從5‘→3’方向水解DNA生長鏈前方的DNA鏈，主要產(chǎn)生5‘-脫氧核苷酸。這種酶活性只對DNA上配對部份(雙鏈)磷酸二酯鍵有切割活力作用，方向是5‘→3’。每次能切除10個核苷酸，而且DNA的聚合作用能刺激5‘→3’外切酶活力達10倍以上。因此，這種酶活性在DNA損傷的修復(fù)中可能起著重要作用。對岡崎片段5'末端DNA引物的去除依賴此種外切酶活性。第五講DNA的復(fù)制DNApolI的5'→3'聚合活性和5'→3'外切酶活性協(xié)同作用，可以使DNA一條鏈上的切口從5'→3'方向移動，這種反應(yīng)叫做缺刻平移，利用此反應(yīng)可在體外對DNA片段進行放射性P標(biāo)記制成探針，進行核酸的分子雜交實驗。第五講DNA的復(fù)制1）、DNA合酶I

第五講DNA的復(fù)制1）、DNA合酶I

第五講DNA的復(fù)制2）、DNA合酶Ⅱ

此酶分子量為120KD，每個細胞約有100個酶分子，但活性只有DNapolⅠ的5%?；钚?′→3′聚合活性3′→5′外切活性而沒有5′→3′外切活性，它的作用可能與DNA損傷修復(fù)有關(guān)。第五講DNA的復(fù)制3）、DNA合酶Ⅲ

這是在DNA復(fù)制過程中起主要作用的聚合酶，它是由一個多亞基組成的蛋白質(zhì)分子，其分子量＞600kDa整個酶分子形成一個不對稱的二聚體，每個大腸桿菌細胞中只有1000個酶分子，但催化dNTP參入DNA鏈的速率卻是最快的，約為9000核苷酸/每分鐘/每個酶分子。這也證明DNapolⅢ是DNA復(fù)制過程中主要發(fā)揮作用的酶。在大腸桿菌染色體DNA進行復(fù)制時，DNA聚合酶Ⅲ全酶并不是單獨起作用的，而是與引發(fā)體等構(gòu)成一個復(fù)制體(replisome)。第五講DNA的復(fù)制3）、DNA合酶Ⅲ

由于復(fù)制體的存在，先導(dǎo)鏈和隨從鏈可以同時復(fù)制。DNapolⅢ是由多亞基組成的不對稱二聚體，它可能同時負責(zé)先導(dǎo)鏈和隨從鏈的復(fù)制。第五講DNA的復(fù)制隨著DNApolⅢ向前移動，先導(dǎo)鏈的合成逐漸延長的同時，崗崎片段也在不斷延長。當(dāng)崗崎片段合成到前一個片段的5′端時，這岡崎片段就釋放出來，由于復(fù)制叉向前移動又可將另一部分隨從鏈的模板置換出來，由引發(fā)體合成新的引物，然后進行新的崗崎片段的合成。由此模型不難看出：隨從鏈的合成需要周期性的引發(fā)，因此其合成進度總是與前導(dǎo)鏈相差一個崗崎片段的長度。第五講DNA的復(fù)制崗崎片段完成后，其5′端的RNA引物由DNapolⅠ的5′→3′外切酶活性切除，由此造成的空隙再由DNApolⅠ的5′→3′聚合活性催化dNTP得到填補。所以DNA的復(fù)制是在DNapolⅢ和DNApolⅠ互相配合下完成的。第五講DNA的復(fù)制原核DNA聚合酶（E.coli)聚合酶Ⅰ聚合酶Ⅱ聚合酶Ⅲ5′→3′聚合酶活性3′→5′外切酶活性5′→3′外切酶活性作用+++DNA損傷的修復(fù)和岡崎片段之間間隙的填補，實踐上其產(chǎn)生的“缺口平移”（nicktrans-lation）技術(shù)也用于分子雜交時的核酸分子探針的標(biāo)記++-DNA的修復(fù)++-DNA復(fù)制中子鏈的延長，為主導(dǎo)聚合酶第五講DNA的復(fù)制（2）、真核生物DNA聚合酶1）、DNA聚合酶α2）、DNA聚合酶β3）、DNA聚合酶γ第五講DNA的復(fù)制2）、DNA聚合酶β

它能以人工合成的多聚脫氧核糖核苷酸為模板，而以適當(dāng)?shù)墓丫勖撗鹾颂呛怂徭湠橐锖铣蒁NA。此酶活性水平穩(wěn)定，可能主要在DNA損傷的修復(fù)中起作用。1）、DNA聚合酶α是真核生物的復(fù)制酶，它在細胞內(nèi)的活性變化與DNA復(fù)制有明顯的平行關(guān)系，在細胞分裂的S期達到高峰。第五講DNA的復(fù)制3）、DNA聚合酶γ它能有效利用人工合成的多聚核糖核酸作為模板，以脫氧核糖核酸鏈為引物合成DNA，但不是反轉(zhuǎn)錄酶。它在分裂細胞中的活性有明顯的變化，細胞進入S期后，它活性升高2倍，然后回到正常水平。它可能在分裂細胞DNA復(fù)制調(diào)控方面起作用。第五講DNA的復(fù)制2、與超螺旋松馳有關(guān)的酶

DNA復(fù)制從起始點開始向一個方向復(fù)制時，局部的DNA雙鏈必須打開，主要靠解鏈酶的作用，打開后的單鏈還需要單鏈結(jié)合蛋白與其結(jié)合，在復(fù)制叉向前移動時造成其前方DNA分子所產(chǎn)生的正超螺旋，必須由拓撲異構(gòu)酶來解決。下面分別介紹它們的作用。第五講DNA的復(fù)制拓撲異構(gòu)酶(topoisomerase)是一類改變DNA拓撲性質(zhì)的酶。在體外可催化DNA的各種拓撲異構(gòu)化反應(yīng)。而在生物體內(nèi)它們可能參與DNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄。在DNA復(fù)制時，復(fù)制叉行進的前方DNA分子部分產(chǎn)生有正超螺旋，拓撲酶可松馳超螺旋，有利于復(fù)制叉的前進及DNA的合成。DNA復(fù)制完成后，拓撲酶又可將DNA分子引入超螺旋，使DNA纏繞、折疊，壓縮以形成染色質(zhì)。

第五講DNA的復(fù)制（四）、DNA復(fù)制的終止階段DNA在復(fù)制過程中，合成出的前導(dǎo)鏈為一條連續(xù)的長鏈。隨從鏈則是由合成出許多相鄰的片段，在連接酶的催化下，連接成為一條長鏈。連接作用是在連接酶催化下進行的。第五講DNA的復(fù)制連接酶(ligase)的作用是催化相鄰的DNA片段以3′、5′－磷酸二酯鍵相連接。連接反應(yīng)中的能量來自ATP(或NAD＋)。連接酶先與ATP作用，以共價鍵相連生成E-AMP中間體。中間體即與一個DNA片段的5′－磷酸相連接形成E-AMP-5′－DNA。然后再與另一個DNA片段的3′-OHH末端作用，E和AMP脫下，兩個DNA片段以3′、5′磷酸二酯鍵相連接。隨從鏈的各個DNA片段就是這樣連接成一條DNA長鏈。

第五講DNA的復(fù)制第五講DNA的復(fù)制已有研究證明大腸桿菌染色體DNA有復(fù)制終止位點此處可以結(jié)合一種特異的蛋白質(zhì)分子叫做Tus，這個蛋白質(zhì)可能是通過阻止解鏈酶(Helicase)的解鏈活性而終止復(fù)制的。詳細的機制還不完全清楚。DNA復(fù)制完成后，靠拓撲酶將DNA分子引入超螺旋結(jié)構(gòu)。

第五講DNA的復(fù)制（五）、復(fù)制的幾種主要方式1、線狀DNA雙鏈的復(fù)制；2、環(huán)狀DNA雙鏈的復(fù)制：1）型復(fù)制；2）滾環(huán)型復(fù)制；3）D-環(huán)型；第五講DNA的復(fù)制1、線狀DNA雙鏈的復(fù)制線狀雙鏈DNA上復(fù)制叉生長方式有單一起始點或多個起始點，在此形成復(fù)制眼，從復(fù)制眼開始復(fù)制叉可以單向(如腺病毒)及雙向(如T7)。真核生物都為多復(fù)制眼起始的雙向復(fù)制。第五講DNA的復(fù)制2、環(huán)形DNA雙鏈的復(fù)制－型大腸桿菌DNA環(huán)狀分子半保留復(fù)制的中間產(chǎn)物就是

型。復(fù)制的起點涉及到DNA雙鏈的解旋和松開，形成兩個方向相反的復(fù)制叉。復(fù)制從ori開始以順時針和逆時針雙向進行時，復(fù)制的中間產(chǎn)物在電鏡下表現(xiàn)為型。第五講DNA的復(fù)制2、環(huán)形DNA雙鏈的復(fù)制－滾環(huán)型環(huán)形DNA雙鏈復(fù)制的一種，為單向復(fù)制。復(fù)制過程中，首先形成共價閉環(huán)的雙鏈分子（RF型），然后其正鏈由一核酸內(nèi)切酶在特定位置切開，游離出3‘羥基和5’磷酸基。5‘磷酸末端在酶的作用下固著在細胞膜上，隨后在DNA聚合酶的作用下，以環(huán)狀負鏈為模板，從正鏈的3’羥基末端加入脫氧核苷酸，使鏈不斷延長，通過滾環(huán)形成新的正鏈。第五講DNA的復(fù)制2、環(huán)形DNA雙鏈的復(fù)制－D環(huán)型單向復(fù)制：雙鏈環(huán)在固定點進行復(fù)制，但兩條鏈的合成高度不對稱，一條鏈先復(fù)制，另一條鏈保持單鏈而被取代，在電鏡下呈D環(huán)形狀。待一條鏈復(fù)制到一定程度，露出另一條鏈的復(fù)制起點，另一條鏈才開始復(fù)制。這表明：兩條鏈的復(fù)制起點并不總在同一點上，當(dāng)兩條鏈的起點分開一定距離時就產(chǎn)生D-環(huán)復(fù)制。第五講DNA的復(fù)制（六）、真核生物DNA的復(fù)制

1、真核生物與原核生物DNA復(fù)制的區(qū)別2、端粒和端粒酶第五講DNA的復(fù)制（六）、真核生物DNA的復(fù)制

1、真核生物與原核生物DNA復(fù)制的區(qū)別（1）、真核生物有多個復(fù)制起點（2）、真核生物的染色體在全部完成之前，各個起點上DNA的復(fù)制不能再開始，而快速生長的原核生物種，復(fù)制起點上可以連續(xù)開始新的DNA復(fù)制，表現(xiàn)為雖只有一個復(fù)制單元，但可以有多個復(fù)制叉。第五講DNA的復(fù)制（六）、真核生物DNA的復(fù)制

2、端粒和端粒酶1）、端粒2）、端粒酶3）、端粒與衰老4）、端粒酶與腫瘤第五講DNA的復(fù)制2、端粒和端粒酶第五講DNA的復(fù)制端粒端粒：真核生物線性染色體3末端的一種特殊結(jié)構(gòu)。核苷酸重復(fù)序列富含G，和端粒結(jié)合蛋白組成核蛋白復(fù)合物。人的DNA端粒含有TTAGGG重復(fù)序列，長度5~15kb。作用：A保護染色體末端免于化學(xué)修飾或核酸酶降解；B解決染色體復(fù)制時末端丟失問題端粒酶能將端粒加到DNA末端的核糖核蛋白復(fù)合物，由多條肽鏈與一個RNA分子組成，端粒酶的蛋白質(zhì)組分具有模板和逆轉(zhuǎn)錄酶的作用，但其逆轉(zhuǎn)錄酶活性只限于應(yīng)用端粒酶特異的RNA作為模板。第五講DNA的復(fù)制端粒酶第五講DNA的復(fù)制端粒與衰老

實驗：在無端粒酶活性的成纖維細胞中表達端粒酶時，端粒的縮短和細胞的衰老都受到抑制。結(jié)論：細胞的衰老是由端粒驅(qū)動的。體外培養(yǎng)的細胞端粒的長度隨細胞逐代相傳而縮短，丟失到一定程度便失去對染色體的保護作用。細胞隨之發(fā)生衰老和死亡。第五講DNA的復(fù)制端粒與衰老可把端?？闯梢幻骁姡肆５拈L度是鐘上的刻度，記載了細胞分裂的次數(shù)，稱為“端粒鐘”，或有絲分裂鐘或“生命的時鐘”，可通過測定端粒的長度預(yù)測細胞的壽命。胚胎細胞和生殖細胞端粒的長度并不隨細胞分裂次數(shù)的增加而縮短，具有無限的分裂能力，原因在于端粒酶的存在。第五講DNA的復(fù)制端粒與腫瘤人體內(nèi)除了生殖細胞和少數(shù)一些體細胞如淋巴細胞等細胞外，絕大多數(shù)體細胞中無法檢測到端粒酶的活性，而在多數(shù)腫瘤細胞中能檢測到端粒酶的活性。腫瘤的端粒長度很短，其繼續(xù)縮短導(dǎo)致染色體融合、細胞死亡，而端粒酶的激活可以維持端粒的長度，維持腫瘤的繼續(xù)分裂、增殖。端粒酶的表達可能是腫瘤形成和發(fā)展的共同途徑。第五講DNA的復(fù)制端粒酶與惡性腫瘤之間有相關(guān)性使之在腫瘤的診斷和治療上有望成為新的靶目標(biāo)。可以通過各種途徑抑制端粒酶的活性有效抑制大多數(shù)腫瘤的生長，而對正常細胞沒有影響。第五講DNA的復(fù)制二、逆轉(zhuǎn)錄酶（一）、逆轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)（二）、逆轉(zhuǎn)錄酶的性質(zhì)（三）、逆轉(zhuǎn)錄酶的功能（四）、逆轉(zhuǎn)錄酶的基因組復(fù)制（五）、逆轉(zhuǎn)錄酶的生物學(xué)意義第五講DNA的復(fù)制（一）、逆轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)1964年，Temin發(fā)現(xiàn)Rous肉瘤病毒等RNA病毒所造成的感染可被DNA合成抑制劑遏制。表明：RNA腫瘤病毒的RNA復(fù)制過程中要合成DNA。Temin又發(fā)現(xiàn)放線菌素D能抑制致癌RNA病毒的復(fù)制，但不能抑制一般RNA病毒的復(fù)制。表明：轉(zhuǎn)錄對于RNA病毒增殖是必需的。第五講DNA的復(fù)制Temin提出前病毒假說：原病毒DNA是RNA腫瘤病毒在復(fù)制和致癌中的中間物。1970年，Temin在Rouse肉瘤病毒、Baltimore在白血病病毒中發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄酶。第五講DNA的復(fù)制（二）、逆轉(zhuǎn)錄酶的性質(zhì)

它是由α亞基和β亞基組成，含有鋅離子；

DNA合成反應(yīng)要求有模板和引物；以四種脫氧核苷三磷酸為底物；DNA合成方向也為5’－3’；需要適當(dāng)濃度的鎂離子和還原劑。第五講DNA的復(fù)制（三）、逆轉(zhuǎn)錄酶的功能RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性；DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性；核糖核酸酶H的活力；沿3’－5’和5’－3’兩個方向核酸外切酶的活力。第五講DNA的復(fù)制（四）、逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因組復(fù)制過程1、由病毒（＋）RNA作為模板合成互補的（－）DNA鏈；2、切除RNA-DNA雜種分子中的RNA，然后由（－）DNA鏈作為模板合成（＋）

DNA；3、形成雙鏈DNA；第五講DNA的復(fù)制第五講DNA的復(fù)制第五講DNA的復(fù)制第五講DNA的復(fù)制乙肝病毒基因組的復(fù)制其復(fù)制需通過逆轉(zhuǎn)錄過程經(jīng)RNA中間體實現(xiàn)，其DNA聚合酶也是一種逆轉(zhuǎn)錄酶。第五講DNA的復(fù)制第五講DNA的復(fù)制逆轉(zhuǎn)錄病毒：RNA→DNA→RNA乙肝病毒：DNA→RNA→DNA第五講DNA的復(fù)制試管內(nèi)cDNA的合成常用于獲得或研究真核生物基因的方法。提取某一種特定的mRNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄生成的cDNA可代表某一特定基因。常用的逆轉(zhuǎn)錄酶有兩種：來自鳥類成髓細胞瘤逆轉(zhuǎn)錄病毒稱為AMV-RT；來自鼠白血病毒稱為MMLV-RT。第五講DNA的復(fù)制第五講DNA的復(fù)制病毒RNA復(fù)制的主要方式1、病毒含有正鏈RNA，如灰質(zhì)炎病毒。RNA（+）→蛋白質(zhì)（酶）→RNA復(fù)制2、病毒含有負鏈RNA和復(fù)制酶如狂犬病毒。RNA（—）→RNA（+）→蛋白質(zhì)、復(fù)制病毒RNA。3、病毒含有雙鏈RNA和復(fù)制酶。如呼腸孤。雙鏈RNA→RNA（+）→蛋白質(zhì)→RNA（—）→雙鏈RNA4、逆轉(zhuǎn)錄病毒。第五講DNA的復(fù)制（五）、逆轉(zhuǎn)錄病毒的生物學(xué)意義1、逆轉(zhuǎn)錄酶存在于所有致癌病毒RNA中。它的存在與RNA病毒引起細胞惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)。了解逆轉(zhuǎn)錄的過程，有助于人們對RNA病毒致癌機制的了解，并對防治腫瘤提供了重要線索。2、常用于獲得或研究真核生物基因的方法。幾乎所有真核生物mRNA分子3’端都有一段多聚腺苷酸，因此加入寡聚dT后，mRNA就可以成為逆轉(zhuǎn)錄酶很好的模板。利用這一方法能夠合成出相應(yīng)于一定mRNA的互補DNA。第五講DNA的復(fù)制三、DNA的轉(zhuǎn)座通常認為基因組是相對穩(wěn)定的，變化只是在漫長的進化過程中發(fā)生。同總的穩(wěn)定性相反，由于多態(tài)變異體的存在，在分子水平上，每個個體基因組之間具有明顯的差異性。這個差異產(chǎn)生的主要原因之一，是被稱為轉(zhuǎn)座的一種機制。第五講DNA的復(fù)制轉(zhuǎn)座子：是存在于染色體DNA上可自主復(fù)制和位移的基本單位。它的標(biāo)志是它不以獨立的形式存在，而在基因組內(nèi)由一個部位直接轉(zhuǎn)移到另一個部位。轉(zhuǎn)座：一個轉(zhuǎn)座子由基因組的一個位置轉(zhuǎn)移到另一個位置的過程。轉(zhuǎn)座酶：促進轉(zhuǎn)座的酶稱為轉(zhuǎn)座酶，轉(zhuǎn)座子常常編碼自己的轉(zhuǎn)座酶，并且每次移動時攜帶轉(zhuǎn)座必須的基因一起在基因內(nèi)躍遷，所以轉(zhuǎn)座子又稱為跳躍基因。第五講DNA的復(fù)制轉(zhuǎn)座是以很低的頻率發(fā)生，而且轉(zhuǎn)座子的插入是隨機的，不依賴于轉(zhuǎn)座子與靶位點之間任何序列的同源性。轉(zhuǎn)座子有時插入到一個結(jié)構(gòu)基因或基因調(diào)節(jié)序列內(nèi)并引起基因表達的改變。有時，轉(zhuǎn)座子也引起基因組序列的重排。研究轉(zhuǎn)座子的意義不僅在于其涉及到DNA的操作機制，它們的移動性也和進化有關(guān)，在基因組內(nèi)，它們也許是突變的主要來源。第五講DNA的復(fù)制三、DNA的轉(zhuǎn)座

（一）轉(zhuǎn)座子的類型（二）轉(zhuǎn)座發(fā)生的機制（三）轉(zhuǎn)座作用的遺傳效應(yīng)第五講DNA的復(fù)制（一）轉(zhuǎn)座子的類型

1、插入序列2、復(fù)合式轉(zhuǎn)座子第五講DNA的復(fù)制1、插入序列（IS）最早被鑒定出來的轉(zhuǎn)座元件是細菌操縱子中的自主插入序列。這種插入阻止了插入部位基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。類型：前綴IS＋數(shù)字轉(zhuǎn)座子常常被定位到特定的基因中，造成該基因突變?？茖W(xué)上用標(biāo)準(zhǔn)命名法對這些突變進行編號，如λ：IS1表示有一個IS1序列插入到λ噬菌體基因組內(nèi)。第五講DNA的復(fù)制（1）、IS元件的結(jié)構(gòu)特征

IS是獨立的結(jié)構(gòu)單位，每個元件只編碼為自身轉(zhuǎn)座所需的蛋白質(zhì)。每種IS元件在序列上皆是不同的，但在結(jié)構(gòu)上具有一些共同的特征。1）、末端的反向重復(fù)序列2）、編碼區(qū)3）、靶位點的正向重復(fù)區(qū)第五講DNA的復(fù)制1）、末端的反向重復(fù)序列123456789---------987654321123456789---------987654321所以類型的轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座皆需末端識別，末端被與轉(zhuǎn)座有關(guān)的轉(zhuǎn)座酶識別。

第五講DNA的復(fù)制2）、編碼區(qū)除IS1外，所有的IS元件皆含有一個單一的長編碼區(qū)，其起始于一端的反向