HYT 176-2014 海水中鐵細菌的測定 MPN法

海水中鐵細菌的測定MPN法Determinationofiron發(fā)布I本標準按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標準由國家海洋局天津海水淡化與綜合利用研究所提出。本標準由全國海洋標準化技術委員會(SAC/TC283)歸口。本標準由國家海洋局天津海水淡化與綜合利用研究所、浙江國華浙能發(fā)電有限公司負責起草。1海水中鐵細菌的測定MPN法本標準規(guī)定了海水中鐵細菌的MPN測定方法。本標準適用于海水及海水利用濃海水中鐵細菌的測定。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T16310.1—1996船舶散裝運輸液體化學品危害性評價規(guī)范水生生物急性毒性試驗方法3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。鐵細菌ironbacteria一類能將溶于水中的棕色亞鐵離子轉變?yōu)椴蝗苡谒暮稚蚝谏趸F水合物的細菌。應用多管發(fā)酵技術，采用概率理論估算細菌濃度的方法。取自未污染海域，裝入玻璃瓶后儲放在暗處15d以上的海水。4方法原理本方法采用多管發(fā)酵技術，在(29±1)℃培養(yǎng)14d,如果試管中棕色消失而且形成褐色或黑色沉淀，表明陽性反應，采用MPN法對被測試樣中的鐵細菌進行計數。5試劑與材料本試驗方法中，除特殊規(guī)定外，應使用分析純試劑和符合GB/T試驗所需試劑與材料如下：6682中三級水規(guī)格的水。a)硫酸鎂；b)硫酸銨；c)磷酸氫二鉀；d)無水氯化鈣，2e)硝酸鈉；f)檸檬酸鐵銨；g)硫代硫酸鈉；h)陳海水；配制；i)人工海水：按GB/T16310.1—1996配制；j)氫氧化鈉溶液：160g/L;k)鹽酸溶液：1+11;1)牛皮紙。6儀器與設備6.1無菌箱(室)或超凈工作臺。6.2蒸汽壓力滅菌器。6.3生化培養(yǎng)箱：(29±1)℃。6.4電熱干燥箱：溫度控制范圍60℃~280℃,允差±2℃。6.5電熱恒溫水浴鍋：恒溫范圍37℃~100℃,允差±1℃。6.6天平：稱量范圍0g～220g,感量0.01g。6.7冰箱。6.8振蕩器。6.9刻度吸管或移液器：1mL、10mL。6.11燒杯：1000mL。6.12無菌試管：直徑18mm,長度180mm,配硅膠塞。6.13無菌刻度吸管或移液器和Tip頭。6.14無菌采樣瓶：廣口玻璃瓶或聚丙烯(PP)塑料瓶。6.15試管架。6.16pH計或精密pH試紙(6.4～8.0)。7試驗前準備7.1培養(yǎng)基的配置成分如下(每升中的含量):a)硫酸鎂b)硫酸銨c)磷酸氫二鉀d)無水氯化鈣e)硝酸鈉f)檸檬酸鐵銨3將7.1.1a)～f)試劑溶解到500mL海水和500mL蒸餾水配制的混合水中，用氫氧化鈉溶液(160g/L)或鹽酸溶液(1+11)調節(jié)pH至6.8±0.2,并分裝在試管(6.12)中，每管5mL～10mL,用蒸汽壓力滅菌器(110±1)℃滅菌30min,冷卻后備用。7.2無菌稀釋水的制備將陳海水或人工海水分裝在試管(6.12)中，每管9mL,用蒸汽壓力滅菌器(121±1)℃滅菌20min,冷卻后備用。7.3硫代硫酸鈉將硫代硫酸鈉放在無菌箱(室)(6.1)內，并均勻地攤放在離紫外線燈的垂直距離30cm處滅菌30min備用。8分析檢測8.1水樣的采集8.1.1用滅菌采樣瓶(6.14)采集被測樣品，在采樣過程中，要保護瓶口和頸部，防止這些部位受雜菌污染，瓶內要留有足夠的空間，以備測定之前搖勻。8.1.2若采集的水樣中有余氯，或在不能判斷水樣中是否有余氯的情況下，應在采樣前，在無菌操作下，于滅菌采樣瓶(6.14)中加入硫代硫酸鈉(7.3),加入量為每升水樣約0.1g。若確定水樣不含余氯，則無需加入硫代硫酸鈉(7.3)。8.1.3水樣采集后，應立即進行測定，如果在2h內不能進行測定，應把水樣放在冰箱中冷藏保存，存放時間不宜超過24h。經冷藏保存后的水樣需測定時，從冰箱中取出，在生化培養(yǎng)箱(6.3)中(29±1)℃活化4h～5h,再進行測定。8.2水樣的稀釋和接種8.2.1按10倍稀釋法對水樣進行系列稀釋，應使最后一個稀釋度接種培養(yǎng)后無鐵細菌生長。8.2.2將不同稀釋度的水樣分別接種到已滅菌的裝有培養(yǎng)基的試管(7.1.2)中，每個稀釋度重復接種3～5管，每管接種1mL,每接種一個稀釋度更換一支無菌吸管或Tip頭(6.13)。8.2.3另取一組已滅菌的裝有培養(yǎng)基的試管(7.1.2),接種1mL無菌稀釋水作為空白對照。在生化培養(yǎng)箱(6.3)中，于(29±1)℃培養(yǎng)14d。9計數與報告9.1如果試管中產生褐色或黑色沉淀且原培養(yǎng)基中棕色消失變?yōu)橥该鳡睿砻饔需F細菌存在，以“+”9.2如果空白對照出現陽性反應，表明測定過程中有污染，本次測定無效。9.3數出10進位稀釋管中陽性試管數，以陽性組合指數記錄下來。9.4在10進位稀釋中多于三個稀釋度時，陽性組合的指數只需要用其中依次的三個稀釋度。以每個4稀釋度接種5管為例，對這三個稀釋度的決定是先選出5管全部陽性反應的最大稀釋度，然后選出與其相連的兩個更高的稀釋度，算出陽性組合指數(見表1例1、例2、例4)。9.5若依照9.4所規(guī)定的原則選出三個稀釋度后，有更高的稀釋度仍然產生一個陽性試管時，就應該將這一個陽性試管并入所選擇的最高稀釋度的陽性結果中(見表1例3)。9.6根據陽性組合的指數，查附錄A得出最大可能菌數，除以陽性組合指數的第一位數字的稀釋度數，即為每毫升水樣中鐵細菌的菌數(如果每個稀釋度重復接種4管或3管，根據陽性組合的指數查附錄B或附錄C)。9.7報告方式見表1。表1計數與報告方式陽性組(個/mL)1552002420053045