HYT 0286-2020 海洋岸灘石油污染微生物修復(fù)指南

中華人民共和國(guó)海洋行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)海洋岸灘石油污染微生物修復(fù)指南Guidelinesforthe發(fā)布中華人民共和國(guó)自然資源部發(fā)布I本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由國(guó)家海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)中心提出。歸口。本標(biāo)準(zhǔn)由全國(guó)海洋標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)海洋環(huán)境保護(hù)分技術(shù)委員會(huì)(SAC/TC283/SC1)本標(biāo)準(zhǔn)主要起草單位：國(guó)家海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)中心、自然資源部第一海洋研究所。歸口。1海洋岸灘石油污染微生物修復(fù)指南本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了海洋岸灘石油污染微生物修復(fù)的流程、技術(shù)要求和方法等內(nèi)容。本標(biāo)準(zhǔn)適用于我國(guó)受石油污染的海洋岸灘的微生物修復(fù)。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T12763.4海洋調(diào)查規(guī)范第4部分：海水化學(xué)要素調(diào)查GB17378.3海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范第3部分：樣品采集、儲(chǔ)存與運(yùn)輸GB17378.4海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范第4部分：海水分析GB17378.5海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范第5部分：沉積物分析GB17378.7海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范第7部分：近海污染生態(tài)調(diào)查和生物監(jiān)測(cè)GB/T21247海面溢油鑒別系統(tǒng)規(guī)范3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。利用微生物的吸收降解作用清除環(huán)境中污染物的一個(gè)自發(fā)或受控的過(guò)程。外源營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)externalnutrients在微生物生活環(huán)境中，為促進(jìn)其生長(zhǎng)代謝人為添加的營(yíng)養(yǎng)鹽物質(zhì)。海洋岸灘marineshoreline被巖石、沙、礫石、泥、生物遺骸覆蓋的海洋沿岸堆積地面，由海水的侵蝕、堆積而成。石油烴降解菌petroleum-degradingbacteria能將石油烴類化合物氧化(輔氧化)成為低分子化合物或完全分解為二氧化碳和水的細(xì)菌。24微生物修復(fù)流程微生物修復(fù)流程見(jiàn)圖1。其他處理方法否海洋岸灘溢油事故發(fā)生現(xiàn)狀調(diào)查與評(píng)估是微生物修復(fù)方法選擇石油烴降解菌豐度≥30%外源營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)添加法石油烴降解菌豐度<30%外源營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及降解菌添加法監(jiān)測(cè)與分析微生物修復(fù)效果評(píng)估否結(jié)果1是結(jié)果2沉積物中石油是否微生物修復(fù)終止圖1海洋岸灘石油污染微生物修復(fù)流程圖5現(xiàn)狀調(diào)查與評(píng)估5.1海洋岸灘類型分類對(duì)石油污染海洋岸灘進(jìn)行分類，確定海洋岸灘類型：根據(jù)我國(guó)海岸特點(diǎn)，可將石油污染海洋岸灘分為暴露巖岸/巖礁、港口區(qū)域/防沖亂石、礫石質(zhì)海灘和沙灘等類型。分類標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。表1海洋岸灘分類標(biāo)準(zhǔn)多石塊海岸，石塊大小不一，且形狀不規(guī)則多為礫石小塊，海洋岸灘較為平整暴露沿岸/巖礁區(qū)域、港口區(qū)域/防沖亂石區(qū)域由于多為大型石塊，并且坡度大，難以進(jìn)行石油烴降解菌噴灑，因此不適用原位微生物修復(fù)方法；而礫石質(zhì)海灘和沙灘多為小石塊和沙質(zhì)，地勢(shì)平坦，石油污3染物易滲入沉積物，適合噴灑石油烴降解菌和外源營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行微生物修復(fù)。5.2石油污染現(xiàn)狀分析海洋岸灘石油污染的樣品采集主要是沉積物樣品(含間隙水)。樣品采集按照GB/T21247的相關(guān)規(guī)定執(zhí)行，樣品保存及運(yùn)輸方法執(zhí)行GB17378.3的規(guī)定。確定被石油污染的海洋岸灘區(qū)域面積、石油滲透至沉積物的深度、石油污染物來(lái)源和濃度，初步測(cè)定石油的黏度和密度，判斷是否可采用微生物修復(fù)降解。5.3污染區(qū)域營(yíng)養(yǎng)鹽分析海洋岸灘石油污染物的微生物降解主要發(fā)生在油-水界面，其降解效果依賴于沉積物間隙水中的營(yíng)養(yǎng)濃度。通過(guò)測(cè)量間隙水背景營(yíng)養(yǎng)鹽的含量，確定是否需要人為施加外源營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。5.4溫度因素微生物修復(fù)技術(shù)在溫暖的季節(jié)(春、夏、秋季節(jié))或15℃以上時(shí)更有效。6微生物修復(fù)方法選擇6.1微生物修復(fù)方法選擇原則根據(jù)污染區(qū)域沉積物間隙水中石油烴降解菌豐度調(diào)查結(jié)果，如果石油烴降解菌的豐度不小于30%時(shí)，可只采用外源營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)添加法；石油烴降解菌豐度小于30%時(shí)，外源營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及石油烴降解菌添加法結(jié)合使用。6.2外源營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的選擇與施加6.2.1外源營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的選擇水溶性和緩釋型營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)都適合于礫石質(zhì)海灘及沙灘。水溶性外源營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在細(xì)、中砂沙灘上更有效，緩釋型營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在礫石質(zhì)海灘及粗砂沙灘上更有效。此外，當(dāng)環(huán)境溫度較高時(shí)，緩釋型外源營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)比水溶性外源營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)將更有效地增加沉積物中的營(yíng)養(yǎng)鹽濃度；當(dāng)環(huán)境溫度較低時(shí)，水溶性外源營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的效果優(yōu)于緩釋型外源營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。6.2.2外源營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的施加外源營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的施加頻率取決于石油污染修復(fù)區(qū)的潮汐波浪特點(diǎn)。宜在低潮期時(shí)對(duì)礫石質(zhì)海灘每3d～4d施加1次外源營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，沙灘每7d施加1次外源營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。施加的外源營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)為氮、磷兩種營(yíng)養(yǎng)鹽元素，氮鹽的初始濃度宜為100mg/L,氮、磷營(yíng)養(yǎng)鹽濃度比范圍為5:1～10:1,并應(yīng)確保其在污染區(qū)域中均勻分布。根據(jù)外源營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的物理形態(tài)，選擇不同的施加方式：均勻撒播緩釋型營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)顆粒，使用手持或背式噴霧器噴灑液體水溶性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。6.3石油烴降解菌的選擇與施加6.3.1石油烴降解菌的選擇從石油污染修復(fù)區(qū)進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)樣品采集，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行石油烴降解菌的篩選和石油降解率的測(cè)定，選出降解率最高的1種～3種石油烴降解菌擴(kuò)大培養(yǎng)后進(jìn)行原位微生物修復(fù)。46.3.2石油烴降解菌的施加將石油烴降解菌配成液體，用手持或背式噴霧器直接噴灑至石油污染區(qū)域。在低潮期進(jìn)行石油烴降解菌的施加，石油烴降解菌的初始濃度宜為10?CFU/L;在石油烴降解菌施加頻率上，微生物修復(fù)前期，施加頻率為1d～3d一次，1周后施加頻率降低為5d～7d一次，每周在菌劑噴灑前進(jìn)行石油烴降解菌分析，若污染區(qū)域石油烴降解菌的豐度顯著提高，則施加頻率降低為一個(gè)月一次，直至微生物修復(fù)7監(jiān)測(cè)與分析石油污染微生物修復(fù)的監(jiān)測(cè)項(xiàng)目和分析方法見(jiàn)表2。微生物修復(fù)開(kāi)始后，應(yīng)分時(shí)段采集岸灘沉積物樣品，根據(jù)當(dāng)?shù)爻毕诘统睍r(shí)段進(jìn)行采樣。表2微生物修復(fù)的監(jiān)測(cè)項(xiàng)目和分析方法監(jiān)測(cè)項(xiàng)目引用標(biāo)準(zhǔn)GC-MS分析總磷8微生物修復(fù)效果評(píng)估8.1表觀監(jiān)視對(duì)比觀察受石油污染區(qū)域和未受污染區(qū)域，如果微生物修復(fù)區(qū)域比未修復(fù)區(qū)域的海洋岸灘表面石油污染面積明顯減小，表明微生物修復(fù)有效。8.2石油降解率計(jì)算檢測(cè)受石油污染區(qū)域和未受石油污染區(qū)域、微生物修復(fù)區(qū)域和未修復(fù)區(qū)域沉積物中石油污染物濃度。根據(jù)沉積物中石油污染物濃度，按式(1)計(jì)算石油降解率：D,=(C?-Cn)/C?×100% (1)式中：D,——石油降解率；C?——修復(fù)前石油污染物濃度，單位為毫克/升(mg/L);Cn——修復(fù)第n天石油污染物濃度，單位為毫克/升(mg/L)。5a)當(dāng)沉積物中石油污染物濃度檢測(cè)值接近污b)當(dāng)微生物修復(fù)方法的使用不能繼續(xù)提高石油降解率或降解率達(dá)到70%以上時(shí)。6(規(guī)范性附錄)石油烴降解菌數(shù)量檢測(cè)——油平板法A.1培養(yǎng)基的配置柴油無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基成分及其配置方法如下：3.0g;CaCl?0.1g;FeCl?0.005g;MnSO?0.002g;ZnCl?0.002g;瓊脂15g;重柴油10mL;蒸餾水1000mL。b)制法：將上述成分(重柴油除外)混勻，調(diào)整pH值至7.5,121℃高壓濕熱滅菌15min;將100mL重柴油單獨(dú)裝于250mL三角瓶，121℃高壓濕熱滅菌15min。然后取10mL滅菌重柴油至上述滅菌培養(yǎng)基中混勻，將此培養(yǎng)基倒入經(jīng)滅菌的各平皿中，每平皿約20mL,待其冷卻凝固，置4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。A.2檢測(cè)步驟石油烴降解菌數(shù)量檢測(cè)步驟如下：a)將無(wú)菌稱取的1g沉積物樣品加入裝有99mL無(wú)菌陳海水的三角瓶中，室溫200r/min,振蕩b)將振蕩均勻的樣品進(jìn)行10倍稀釋，根據(jù)采樣季節(jié)與溢油區(qū)距離等環(huán)境因素選取適當(dāng)稀釋度的樣品進(jìn)行分離培養(yǎng)；c)選取適當(dāng)稀釋梯度樣品0.1mL到滅菌柴油無(wú)機(jī)鹽平板上，無(wú)菌涂布均勻，每個(gè)稀釋度重復(fù)d)待樣品均勻滲透到培養(yǎng)基后，將接種后的滅菌柴油無(wú)機(jī)鹽平板置28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)e)選擇菌落數(shù)在30個(gè)～300個(gè)之間的平皿，以平均菌落數(shù)乘其稀釋倍數(shù)，即為樣品中的石油烴降解菌數(shù)。[1]牟穎，嚴(yán)良政.近岸海域石油污染生物修復(fù)技術(shù)的研究進(jìn)展[J].工業(yè)安全與環(huán)保，2012,38[2]鄭立，崔志松，高偉，等.海洋石油降解菌劑在大連溢油污染岸灘修復(fù)中的應(yīng)用研究[J].海洋[3]何云馨.不同類型溢油污染潮間帶生物修復(fù)可行性現(xiàn)場(chǎng)中試研究[D].山東：中國(guó)海洋大[5]王麗娜.海洋近岸溢油污染微生物修復(fù)技術(shù)的應(yīng)用基礎(chǔ)研究[D].山東：中國(guó)海洋大學(xué)，2013.[7]蔡鋒.華南沙質(zhì)海灘動(dòng)力地貌過(guò)程[D].山東：中國(guó)海洋大學(xué)，2[8]李金成，鄭西來(lái)，夏文香，等.石油污染海灘的生物修復(fù)實(shí)踐及營(yíng)養(yǎng)施加策略[J].海洋湖沼通[9]唐晨光.營(yíng)養(yǎng)鹽對(duì)微生物降解海水中石油污染物的影響及條件優(yōu)化[D].山東：青島理工大[10]楊仕美.高效石油烴降解菌劑的制備及其在溢油污染海岸線生物修復(fù)中的應(yīng)用[D].中國(guó)海[11]XZhu,ADVenosa,MTSuidan,KLee.Guidelinesshorelinesandfreshwaterwetlands,2001[R].Cincinnati,O[12]Envir