DB32-T 3274-2017紫甘薯種苗病毒檢測技術(shù)規(guī)程

ICS65.020.20

B23

備案號(hào)：54543-2017DB32

江蘇省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB32/T3274—2017

紫甘薯種苗病毒檢測技術(shù)規(guī)程

TechnicalregulationforvirusdetectionofPurple-fleshedsweetpotatoseedlings

2017-07-01發(fā)布2017-08-01實(shí)施

江蘇省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布

DB32/T3274—2017

紫甘薯種苗病毒檢測技術(shù)規(guī)程

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了紫甘薯種苗的質(zhì)量要求和檢測方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于紫甘薯種薯（苗）繁育、生產(chǎn)、銷售過程中的質(zhì)量鑒定。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB4406-1984種薯

GB7413-2009甘薯種苗產(chǎn)地檢疫規(guī)程

NY/T402-2016脫毒甘薯種薯（苗）病毒檢測技術(shù)規(guī)程

NY/T1200-2006甘薯脫毒種薯

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用本文件。

3.1

甘薯種苗sweetpotatoseedlings

從育種家種子開始，經(jīng)逐代繁殖增加種薯（苗）數(shù)量的種薯生產(chǎn)體系生產(chǎn)出來的種薯（苗）。分為

育種家種子、原原種、原種、生產(chǎn)用種四個(gè)級(jí)別。

3.2

育種家種子breeder’sseed

由育種者直接生產(chǎn)和掌握的原始種子，具有該品種的典型性和遺傳穩(wěn)定性，純度100%，不帶病毒

和其他病蟲害，產(chǎn)量及其他主要性狀符合推廣時(shí)的原有水平。

3.3

原原種pre-elite

用育種家種子或典型品種的脫毒試管苗在防蟲網(wǎng)室、溫室條件下生產(chǎn)的符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的種薯（苗）。

3.4

原種elite

用原原種作種薯，在良好隔離條件下生產(chǎn)的符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的種薯（苗）。

1

DB32/T3274—2017

3.5

生產(chǎn)用種certifiedseed

用原種作種薯，在良好隔離條件下生產(chǎn)的符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的種薯（苗）。

4縮略語

甘薯羽狀斑駁病毒（sweetpotatofeatherymottlevirus,SPFMV）。

甘薯潛隱病毒（sweetpotatolatentvirus,SPLV）

甘薯褪綠斑病毒（sweetpotatochloroticfecksvirus,SPCFV）

5質(zhì)量要求

各級(jí)別種薯（苗）繁殖田中帶病植株允許率應(yīng)符合表1的要求。

表1各級(jí)別種薯（苗）繁殖田中允許病毒檢出率(%)

種薯級(jí)別育種家種子原原種原種生產(chǎn)用種

苗期00≤5.0≤10.0

封壟前00≤3.0≤10.0

收獲前2周00≤2.0≤10.0

6檢測方法

6.1檢測樣本的選擇

6.1.1脫毒試管苗

對(duì)每個(gè)單株進(jìn)行檢測。淘汰帶毒單株，經(jīng)檢測確定無病毒的才繼續(xù)擴(kuò)繁。

6.1.2育種家種子、原原種和原種

于苗期、封壟前和收獲前2周，在目測全田，淘汰顯癥苗的基礎(chǔ)上，采用隨機(jī)取樣法，抽樣數(shù)量為：

面積小于等于0.1hm2，檢驗(yàn)2點(diǎn)，每點(diǎn)100株；面積大于0.1hm2小于等于1hm2，檢驗(yàn)5點(diǎn)，每點(diǎn)100株；

超過1hm2面積，劃出另一檢驗(yàn)區(qū)，按本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定面積取樣。病毒檢測每株取莖蔓上、中、下部葉片各1

片，24h內(nèi)檢測（見表2）。

6.1.3生產(chǎn)用種

于封壟前、收獲前2周，在目測全田，淘汰顯癥苗的基礎(chǔ)上，采用隨機(jī)取樣法，面積小于0.1hm2，

檢驗(yàn)2點(diǎn)，每點(diǎn)100株；面積大于0.1hm2小于等于1hm2，檢驗(yàn)5點(diǎn)，每點(diǎn)100株；面積大于1hm2小于等于

5hm2，檢驗(yàn)10點(diǎn)，每點(diǎn)100株；超過5hm2面積，劃出另一檢驗(yàn)區(qū)，按本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定面積取樣。取樣方法同

原種。見表2。

注：在進(jìn)行病毒檢測時(shí)，原原種每5株混樣；原種或生產(chǎn)用種混合后二次抽樣，隨機(jī)抽取10%～50%的混合樣品檢測，

抽取樣品最低數(shù)量為100株。

2

DB32/T3274—2017

表2各級(jí)別種薯（苗）繁殖田中在不同種植面積中的抽樣數(shù)量

種薯級(jí)別育種家種子原原種原種生產(chǎn)用種

面積≤0.1hm22點(diǎn)2點(diǎn)2點(diǎn)2點(diǎn)

0.1hm2＜面積≤1

5點(diǎn)5點(diǎn)5點(diǎn)5點(diǎn)

hm2

1hm2＜面積≤5hm2劃出另一檢驗(yàn)區(qū)，按本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定面積取樣10點(diǎn)

面積＞5hm2劃出另一檢驗(yàn)區(qū)，按本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定面積取樣

注：每點(diǎn)取樣100株

6.2酶聯(lián)免疫檢測法

當(dāng)單株苗展開葉達(dá)6片以上時(shí)進(jìn)行檢測，按株取其上、中、下部葉片用于酶聯(lián)免疫檢測，剩余植株

部分繼續(xù)生長。用酶聯(lián)免疫檢測法初檢后，淘汰顯陽性反應(yīng)的單株。

6.2.1樣品制備

將待測葉片用清水清洗干凈，從每一樣品葉片上各取一直徑約1cm圓片，放入樣品袋中，加入3mL

抽提緩沖液充分研磨，4℃靜置30min～40min，取澄清液點(diǎn)樣。樣品為塊根時(shí)，催芽處理后取幼芽、

葉制樣。

6.2.2檢測步驟

6.2.2.1點(diǎn)樣

將打好方格的硝化纖維素膜用TBS緩沖液處理后放在潔凈的濾紙上，每個(gè)樣品各吸取17uL上清液

滴在膜上方格的正中，干燥15min～30min。同時(shí)設(shè)陽性、陰性和空白對(duì)照，可根據(jù)需要設(shè)置重復(fù)。

6.2.2.2封閉

將干燥后的膜浸泡在封閉緩沖液中，室溫下?lián)u床振蕩1h(50r/min)。

6.2.2.3孵育第一抗體及洗滌

將膜置于用抗體緩沖液稀釋至工作濃度的抗血清中，室溫下?lián)u床振蕩過夜(50r/min)。用洗滌緩沖液

洗膜3次，每次搖床振蕩3min(100r/min)。

6.2.2.4孵育第二抗體

將膜置于用抗體緩沖液稀釋至工作濃度的酶標(biāo)抗體中，室溫下?lián)u床振蕩1h(50r/min)。洗滌緩沖液

洗膜3次，每次搖床振蕩3min(100r/min)。

6.2.2.5顯色

將膜置于NBT/BCIP底物溶液中，室溫下?lián)u床振蕩孵育30min(50r/min)。

6.2.2.6終止反應(yīng)

棄去底物溶液并用蒸餾水洗膜3次，每次搖床振蕩3min(100r/min)。

6.2.2.7陽性判斷

3

DB32/T3274—2017

晾干后觀察顏色反應(yīng)，出現(xiàn)藍(lán)紫色反應(yīng)的樣品為陽性。

6.3指示植物檢測確認(rèn)

通過酶聯(lián)免疫檢測法檢測的健康株繼續(xù)擴(kuò)繁，經(jīng)指示植物檢測，指示植物不顯癥的才能確認(rèn)為無毒

種苗。經(jīng)檢測確認(rèn)的健康種苗繼續(xù)擴(kuò)繁。

6.3.1材料準(zhǔn)備

6.3.1.1將待檢測的脫毒苗或種苗盆栽于防蟲措施良好的溫室中。

6.3.1.2盆播指示植物——巴西牽牛（Ipomoeasetosa），花盆直徑不小于10cm，每待檢測樣品及陽性

對(duì)照各需生長健壯巴西牽牛5株。

6.3.2嫁接

巴西牽牛生長出1片～2片真葉時(shí)嫁接，以待檢測樣品莖蔓為接穗，巴西牽牛為砧木。將待檢測樣品

莖蔓中下部莖段切成3段～5段，每個(gè)接穗帶一個(gè)單芽及葉片，去葉后將底端削成楔形，插入巴西牽牛砧

木切口內(nèi)，封口膜扎緊。嫁接后白天保持氣溫26℃～36℃，相對(duì)濕度80%～90%，適當(dāng)遮陰，嫁接成活

后，給予充足光照。

6.3.3陽性判斷

嫁接后2周～3周顯癥，在所有嫁接指示植物中只要有一株表現(xiàn)典型癥狀即為陽性。癥狀為：

SPFMV羽狀斑駁

SPLV葉脈變黃

SPCFV葉片褪綠斑

4

DB32/T3274—2017

AA

附錄A

（資料性附錄）

斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫檢測法（DOT-ELISA）所用試劑

斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫檢測法（DOT-ELISA）所用試劑

所用化學(xué)試劑為分析純級(jí)規(guī)格，用水為蒸餾水。

A.1在羥甲基氨基甲烷（TBS）(pH7.5)

TrisBase4.84g

氯化鈉（NaCl）58.44g

疊氮鈉（NaN3）0.40g

溶于1990mL蒸餾水中，用鹽酸（37%）調(diào)pH至7.5，定容至2000mL。

洗滌緩沖液（T-TBS）

1.0mL吐溫-20（Tween-20）溶于2000mLTBS中。

A.2抽提緩沖液

亞硫酸鈉（Na2SO3）0.2g溶于TBS中，定容至100mL。

A.3封閉緩沖液（現(xiàn)用現(xiàn)配）

脫脂奶粉0.50g

粹通X-100（TritonX1-00）0.5mL

TBS25mL

先將脫脂奶粉溶于少量TBS中，再用TBS定容至25mL。加入TritonX-100混合均勻。

A.4抗體稀釋緩沖液

脫脂奶粉1.00g

TBS50mL

先將脫脂奶粉溶于少量TBS中，再用TBS定容至50mL。

A.5底物緩沖液（pH9.5）

TrisBase6.05g

氯化鈉（NaCl）2.92g

氯化鎂（MgCl2·6H2O）0.51g

疊氮鈉（NaN3）0.05g

溶于450mL蒸餾水中，用濃鹽酸調(diào)pH至9.5，定容至500mL。

5

DB32/T3274—2017

A.6硝基藍(lán)四唑鹽（NBT）和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯（BCIP）儲(chǔ)備液

NBT儲(chǔ)備液：

NBT0.04g

70%N,N-二甲基甲酰胺1.2mL

混合均勻，4℃避光保存。

BCIP儲(chǔ)備液：

BCIP0.02g

70%N,N-二甲基甲酰胺1.2mL

混合均勻，4℃避光保存。

A.7底物溶液（現(xiàn)用現(xiàn)配）

底物緩沖液25mL

NBT儲(chǔ)備液75uL

BCIP儲(chǔ)備液75uL

6

DB32/T3274—2017

BB

附錄B

（資料性附錄）

紫甘薯種苗病毒檢測報(bào)告樣式

檢測人：

檢測單位蓋章

年月日

________________________

7

DB32/T3274—2017

前??言

本標(biāo)準(zhǔn)按GB/T1.1—2009《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫》的要求編寫。

本標(biāo)準(zhǔn)由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提出并歸口。

本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所。

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：邊小峰、馬佩勇、賈趙東、謝一芝、郭小丁、禹陽。

I

DB32/T3274—2017

紫甘薯種苗病毒檢測技術(shù)規(guī)程

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了紫甘薯種苗的質(zhì)量要求和檢測方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于紫甘薯種薯（苗）繁育、生產(chǎn)、銷售過程中的質(zhì)量鑒定。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB4406-1984種薯

GB7413-2009甘薯種苗產(chǎn)地檢疫規(guī)程

NY/T402-2016脫毒甘薯種薯（苗）病毒檢測技術(shù)規(guī)程

NY/T1200-2006甘薯脫毒種薯

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用本文件。

3.1

甘薯種苗sweetpotatoseedlings

從育種家種子開始，經(jīng)逐代繁殖增加種薯（苗）數(shù)量的種薯生產(chǎn)體系生產(chǎn)出來的種薯（苗）。分為

育種家種子、原原種、原種、生產(chǎn)用種四個(gè)級(jí)別。

3.2

育種家種子breeder’sseed

由育種者直接生產(chǎn)和掌握的原始種子，具有該品種的典型性和遺傳穩(wěn)定性，純度100%，不帶病毒

和其他病蟲害，產(chǎn)量及其他主要性狀符合推廣時(shí)的原有水平。

3.3

原原種pre-elite

用育種家種子或典型品種的脫毒試管苗在防蟲網(wǎng)室、溫室條件下生產(chǎn)的符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的種薯（苗）。

3.4

原種elite

用原原種作種薯，在良好隔離條件下生產(chǎn)的符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的種薯（苗）。

1

DB32/T3274—2017

3.5

生產(chǎn)用種certifiedseed

用原種作種薯，在良好隔離條件下生產(chǎn)的符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的種薯（苗）。

4縮略語

甘薯羽狀斑駁病毒（sweetpotatofeatherymottlevirus,SPFMV）。

甘薯潛隱病毒（sweetpotatolatentvirus,SPLV）

甘薯褪綠斑病毒（sweetpotatochloroticfecksvirus,SPCFV）

5質(zhì)量要求

各級(jí)別種薯（苗）繁殖田中帶病植株允許率應(yīng)符合表1的要求。

表1各級(jí)別種薯（苗）繁殖田中允許病毒檢出率(%)

種薯級(jí)別育種家種子原原種原種生產(chǎn)用種

苗期00≤5.0≤10.0

封壟前00≤3.0≤10.0

收獲前2周00≤2.0≤10.0

6檢測方法

6.1檢測樣本的選擇

6.1.1脫毒試管苗

對(duì)每個(gè)單株進(jìn)行檢測。淘汰帶毒單株，經(jīng)檢測確定無病毒的才繼續(xù)擴(kuò)繁。

6.1.2育種家種子、原原種和原種

于苗期、封壟前和收獲前2周，在目測全田，淘汰顯癥苗的基礎(chǔ)上，采用隨機(jī)取樣法，抽樣數(shù)量為：

面積小于等于0.1hm2，檢驗(yàn)2點(diǎn)，每點(diǎn)100株；面積大于0.1hm2小于等于1hm2，檢驗(yàn)5點(diǎn)，每點(diǎn)100株；

超過1hm2面積，劃出另一檢驗(yàn)區(qū)，按本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定面積取樣。病毒檢測每株取莖蔓上、中、下部葉片各1

片，24h內(nèi)檢測（見表2）。

6.1.3生產(chǎn)用種

于封壟前、收獲前2周，在目測全田，淘汰顯癥苗的基礎(chǔ)上，采用隨機(jī)取樣法，面積小于0.1hm2，

檢驗(yàn)2點(diǎn)，每點(diǎn)100株；面積大于0.1hm2小于等于1hm2，檢驗(yàn)5點(diǎn)，每點(diǎn)100株；面積大于1hm2小于等于

5hm2，檢驗(yàn)10點(diǎn)，每點(diǎn)100株；超過5hm2面積，劃出另一檢驗(yàn)區(qū)，按本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定面積取樣。取樣方法同

原種。見表2。

注：在進(jìn)行病毒檢測時(shí)，原原種每5株混樣；原種或生產(chǎn)用種混合后二次抽樣，隨機(jī)抽取10%～50%的混合樣品檢測，

抽取樣品最低數(shù)量為100株。

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DB32/T3274—2017

表2各級(jí)別種薯（苗）繁殖田中在不同種植面積中的抽樣數(shù)量

種薯級(jí)別育種家種子原原種原種生產(chǎn)用種

面積≤0.1hm22點(diǎn)2點(diǎn)2點(diǎn)2點(diǎn)

0.1hm2＜面積≤1

5點(diǎn)5點(diǎn)5點(diǎn)5點(diǎn)

hm2

1hm2＜面積≤5hm2劃出另一檢驗(yàn)區(qū)，按本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定面積取樣10點(diǎn)

面積＞5hm2劃出另一檢驗(yàn)區(qū)，按本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定面積取樣

注：每點(diǎn)取樣100株

6.2酶聯(lián)免疫檢測法

當(dāng)單株苗展開葉達(dá)6片以上時(shí)進(jìn)行檢測，按株取其上、中、下部葉片用于酶聯(lián)免疫檢測，剩余植株

部分繼續(xù)生長。用酶聯(lián)免疫檢測法初檢后，淘汰顯陽性反應(yīng)的單株。

6.2.1樣品制備

將待測葉片用清水清洗干凈，從每一樣品葉片上各取一直徑約1cm圓片，放入樣品袋中，加入3mL

抽提緩沖液充分研磨，4℃靜置30min～40min，取澄清液點(diǎn)樣。樣品為塊根時(shí)，催芽處理后取幼芽、

葉制樣。

6.2.2檢測步驟

6.2.2.1點(diǎn)樣

將打好方格的硝化纖維素膜用TBS緩沖液處理后放在潔凈的濾紙上，每個(gè)樣品各吸取17uL上清液

滴在膜上方格的正中，干燥15min～30min。同時(shí)設(shè)陽性、陰性和空白對(duì)照，可根據(jù)需要設(shè)置重復(fù)。

6.2.2.2封閉

將干燥后的膜浸泡在封閉緩沖液中，室溫下?lián)u床振蕩1h(50r/min)。

6.2.2.3孵育第一抗體及洗滌

將膜置于用抗體緩沖液稀釋至工作濃度的抗血清中，室溫下?lián)u床振蕩過夜(50r/min)。用洗滌緩沖液

洗膜3次，每次搖床振蕩3min(100r/min)。

6.2.2.4孵育第二抗體

將膜置于用抗體緩沖液稀釋至工作濃度的酶標(biāo)抗體中，室溫下?lián)u床振蕩1h(50r/min)。洗滌緩沖液

洗膜3次，每次搖床振蕩3min(100r/min)。

6.2.2.5顯色

將膜置于NBT/BCIP底物溶液中，室溫下?lián)u床振蕩孵育30min(50r/min)。

6.2.2.6終止反應(yīng)

棄去底物溶液并用蒸餾水洗膜3次，每次搖床振蕩3min(100r/min)。

6.2.2.7陽性判斷

3

DB32/T3274—2017

晾干后觀察顏色反應(yīng)，出現(xiàn)藍(lán)紫色反應(yīng)的樣品為陽性。

6.3指示植物檢測確認(rèn)

通過酶聯(lián)免疫檢測法檢測的健康株繼續(xù)擴(kuò)繁，經(jīng)指示植物檢測，指示植物不顯癥的才能確認(rèn)為無毒

種苗。經(jīng)檢測確認(rèn)的健康種苗繼續(xù)擴(kuò)繁。

6.3.1材料準(zhǔn)備

6.3.1.1將待檢測的脫毒苗或種苗盆栽于防蟲措施良好的溫室中。

6.3.1.2盆播指示植物——巴西牽牛（Ipomoeasetosa），花盆直徑不小于10cm，每待檢測樣品及陽性

對(duì)照各需生長健壯巴西牽牛5株。

6.3.2嫁接

巴西牽牛生長出1片～2片真葉時(shí)嫁接，以待檢測樣品莖蔓為接穗，巴西牽牛為砧木。將待檢測樣品

莖蔓中下部莖段切成3段～5段，每個(gè)接穗帶一個(gè)單芽及葉片，去葉后將底端削成楔形，插入巴西牽牛砧

木切口內(nèi)，封口膜扎緊。嫁接后白天保持氣溫26℃～36℃，相