(4.6)-自主實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)踐課題申請(qǐng)書(shū)

生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)自主實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)踐課題申請(qǐng)書(shū)摘要課題研究?jī)?nèi)容和意義簡(jiǎn)介：目前關(guān)于酵母種蔗糖酶的提取的研究報(bào)告較多，本文將從各種細(xì)胞破碎方法的原理、與優(yōu)缺點(diǎn)、緩沖液的選擇、分級(jí)沉淀技術(shù)以及蛋白透析技術(shù)著手進(jìn)行蔗糖酶提取與純化的實(shí)驗(yàn)。本次專題報(bào)告，能夠?yàn)槲覀冊(cè)黾訉?duì)“蔗糖酶的提取”的進(jìn)一步了解，在自主實(shí)驗(yàn)中更好的了解背景研究以及提供思路。關(guān)鍵詞（用分號(hào)分開(kāi)，最多5個(gè)）細(xì)胞破碎；緩沖液的選擇；分級(jí)沉淀；蛋白質(zhì)透析基本信息立題依據(jù)與研究?jī)?nèi)容：1、課題的立題依據(jù)。由于我們組在秋學(xué)期蔗糖酶系列實(shí)驗(yàn)中對(duì)于酵母的研磨和蔗糖酶的純化所得到的結(jié)果并不是很理想，因此我們?cè)诙瑢W(xué)期的自主探究實(shí)驗(yàn)中，決定進(jìn)一步對(duì)“蛋白質(zhì)的提取純化”這一主題進(jìn)行研究，并決定將所了解到的關(guān)于蛋白質(zhì)的提取的知識(shí)“知行合一”地融入到實(shí)踐中去，更好地吸收、理解蛋白質(zhì)的提取這一方面的學(xué)識(shí)。2、課題的研究?jī)?nèi)容、研究目標(biāo),以及擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題。（1）研究?jī)?nèi)容：目前關(guān)于酵母中蔗糖酶提取純化方面的研究較多1-5，提取方法以超聲破碎法、凍融法、高速珠磨法3種不同的方法最為常見(jiàn)，以下將對(duì)這三種蔗糖酶的提取方法進(jìn)行研究。（2）研究目標(biāo)：學(xué)習(xí)三種提取方法并比較其優(yōu)缺點(diǎn)以及蛋白質(zhì)的提取率，學(xué)習(xí)蛋白質(zhì)透析方法與技術(shù)，比較其與離子交換層析純化方法的不同與優(yōu)劣。（3）擬解決關(guān)鍵問(wèn)題：三種提取方法的可行性，透析技術(shù)的學(xué)習(xí)。3、擬采取的研究方案及可行性分析（1）提取超聲破碎法常?頻?于15～20KHz的超聲波處理細(xì)胞懸液，使細(xì)胞急劇震蕩破裂，此法多適?于微?物材料，在?強(qiáng)度聲能輸?下可以進(jìn)?細(xì)胞破碎。其破碎機(jī)理與空化現(xiàn)象引起的沖擊波和剪切力有關(guān)。但是酵母細(xì)胞壁厚,單純超聲破碎酵母細(xì)胞的方法總體效率不高凍融法在冷凍過(guò)程中，低溫會(huì)促使細(xì)胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂，從而增加細(xì)胞的親水性能；反復(fù)冷凍能夠使細(xì)胞內(nèi)形成冰晶，引起細(xì)胞膨脹而破裂。由于整個(gè)提取過(guò)程保持較低溫度，酶失活率較低，因此使用凍融法提取蔗糖酶能夠更好的促進(jìn)細(xì)胞破碎，保留蔗糖酶活性。物理剪切法物理剪切法中，高速珠磨法是一種有效的破碎方法，珠磨機(jī)是該法所用的設(shè)備。進(jìn)入珠磨機(jī)內(nèi)的細(xì)胞懸浮液與極細(xì)的玻璃小珠、石英砂、氧化鋁等研磨劑一起快速攪拌或研磨，珠子之間以及珠子與細(xì)胞之間的相互剪切、碰撞,使細(xì)胞破碎,釋放出內(nèi)含物。（2）純化在蔗糖酶的提取純化中，一般選擇使用乙醇進(jìn)行分級(jí)沉淀1，3，相較于乙醇單次沉淀具有更好的純化效果。（3）透析透析可以除去鹽、有機(jī)溶劑以及分子量小于透析袋規(guī)格的雜蛋白，充分保留所需蛋白。但為了獲得較好透析效果的同時(shí)保持蛋白質(zhì)的活，性需要長(zhǎng)時(shí)間在低溫環(huán)境下進(jìn)行并且不停更換緩沖液，總體流程所需時(shí)間較長(zhǎng)。4、課題的特色與創(chuàng)新之處相較于秋學(xué)期系列實(shí)驗(yàn)，本組的自主實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化了蔗糖酶提取方法和初步純化方法，采用了一種新的提純方法——透析法，在保留了釀酒酵母全蛋白的基礎(chǔ)上進(jìn)行蛋白透析以確保蔗糖酶的充分保留，避免因離子交換層析純化蔗糖酶過(guò)程中較復(fù)雜步驟導(dǎo)致的操作失誤。同時(shí)，通過(guò)對(duì)比全蛋白直接透析與乙醇分級(jí)沉淀初步提純后透析，可以比較得出乙醇提純的效果，驗(yàn)證該提純步驟對(duì)于蔗糖酶活性的影響。5、研究計(jì)劃及預(yù)期研究結(jié)果圖1實(shí)驗(yàn)流程與設(shè)計(jì)圖冬學(xué)期自主實(shí)驗(yàn)流程設(shè)計(jì)圖見(jiàn)圖1。研究計(jì)劃：由于實(shí)驗(yàn)室設(shè)備與材料限制，預(yù)想使用的球磨法因沒(méi)有酸洗玻璃珠無(wú)法實(shí)行，故采用超聲波破碎法。取10g市售酵母菌，加入20mL的20mmol/LTris-HCl緩沖液（pH6.7）溶解，使用超聲波細(xì)胞破碎儀，Ⅳ檔下以60%功率，運(yùn)行15s/間隔10s條件進(jìn)行細(xì)胞破碎30min，處理后得到米黃色渾濁溶液，4℃、12000r/min離心15min，取1mL上清液留作樣品Ⅰ用于酵母蛋白含量測(cè)定和蔗糖酶活力測(cè)定。將留樣后的上清液均分為兩份，一份經(jīng)過(guò)50℃水浴30min的熱處理后4℃下12000r/min離心15min，取上清液并留樣1mL作樣品Ⅱ；向熱處理后的上清液中加入乙醇使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)30%，4℃、12000r／min離心15min，取上清液再追加乙醇使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)50％。4℃、12000r／min離心15min，棄上清液，往沉淀中加入10mL的20mmol/LTris-HCl緩沖液將沉淀溶解，并取1mL留作樣品Ⅲ；將上述蛋白粗提液裝入透析袋（100kD，MD34，Biosharp）中進(jìn)行透析，透析后取袋內(nèi)液體，4℃、12000r/min離心10min，取上清液作樣品Ⅳ。另一份直接裝入透析袋中透析，袋內(nèi)液體經(jīng)4℃、12000r/min離心10min后取上清液作樣品Ⅴ。兩組透析操作相同，透析液均使用20mmol/LTris-HCl緩沖液，為防止袋內(nèi)溶液濃度過(guò)高，液體流入較多導(dǎo)致透析袋撐破，每1-2日觀察情況并更換透析液，持續(xù)5-7日。第二周起對(duì)第一周實(shí)驗(yàn)所得的樣品Ⅰ-Ⅴ進(jìn)行蛋白含量與蔗糖酶活力測(cè)定，采用方法與秋學(xué)期所用的相同，使用Folin-酚法測(cè)定蛋白濃度與含量、DNS法測(cè)定蔗糖酶活性，此處不再贅述。第三周起對(duì)樣品進(jìn)行SDS電泳，操作與秋學(xué)期相同。進(jìn)行SDS電泳的目的是驗(yàn)證透析操作的效果，結(jié)合第二周所得蛋白含量與蔗糖酶活性的數(shù)據(jù)對(duì)透析法的優(yōu)劣進(jìn)行分析。相關(guān)分析請(qǐng)見(jiàn)下文“預(yù)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果”部分。預(yù)期研究結(jié)果：在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)之前，預(yù)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果為：分析樣品Ⅰ，相較于秋學(xué)期用的研磨破碎法，超聲波破碎法對(duì)細(xì)胞的破碎較為完全，蛋白釋放率更高；分析樣品Ⅳ和Ⅴ，相較于全蛋白直接透析，經(jīng)過(guò)熱處理和乙醇分級(jí)沉淀處理后透析所得的蛋白中蔗糖酶純度更高；結(jié)果SDS電泳結(jié)果表明，樣品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的總蛋白含量較高，雜蛋白的含量也很高，兩者根據(jù)處理步驟依次遞減，即總蛋白含量與雜蛋白比例均為：Ⅰ>Ⅱ>Ⅲ；樣品Ⅳ與Ⅴ經(jīng)過(guò)透析后，蔗糖酶含量幾乎不變，雜蛋白含量顯著減少，尤其是分子量100kD以下的雜蛋白幾乎完全濾出。透析法對(duì)于蔗糖酶的提純有較好的效果且操作簡(jiǎn)單，步驟較少。經(jīng)過(guò)第一周的實(shí)驗(yàn)后，對(duì)于自主實(shí)驗(yàn)有了新的分析。具體如下：根據(jù)相關(guān)研究3，玻璃珠破碎法（高速珠磨法）對(duì)于酵母全蛋白的釋放與提取最為理想，蛋白濃度可達(dá)0.92±0.01g/L，超聲波破碎法的效果較差，蛋白濃度為0.78±0.03g/L。是我們組秋學(xué)期采用的研磨破碎法（濕法研磨）所得樣品Ⅰ的蛋白濃度僅有11.87mg/L，相較之下無(wú)論是采用珠磨法還是使用超聲波法都可以近百倍的提升蛋白的提取率，保證后續(xù)純化實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。原先設(shè)想采用100kD與200kD規(guī)格的兩種透析袋分別透析并對(duì)比，但200kD規(guī)格的透析袋較少，未能購(gòu)得，因此僅使用了100kD規(guī)格的透析袋進(jìn)行試驗(yàn)。由于蔗糖酶外酶的分子量約為270kD，內(nèi)酶的分子量約為135kD，且外酶的活性較高，因此使用100kD透析袋對(duì)于保留蔗糖酶內(nèi)酶的效果較好，但也會(huì)導(dǎo)致雜蛋白含量更高，蔗糖酶所占比例下降，活性降低。結(jié)合對(duì)于釀酒酵母全蛋白組的研究6-10，參考其對(duì)于酵母近全蛋白組的電泳結(jié)果（見(jiàn)圖2），大部分蛋白質(zhì)的分子量集中在20-100kD區(qū)間，100kD與200kD以上的蛋白質(zhì)較少，因此我認(rèn)為使用100kD規(guī)格的透析袋進(jìn)行透析與使用200kD規(guī)格透析袋最終所得結(jié)果相近，透析后液體所含雜蛋白增多但不會(huì)有顯著區(qū)別，不影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)行。圖2酵母全蛋白的電泳結(jié)果與分析通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)與專利所知，釀酒酵母內(nèi)有多種蛋白水解酶（protease），已知有膠原蛋白酶11（collagenases）、Caspase蛋白酶家族、Caspase同系物Matacaspase（Mca1）12等多種蛋白酶13-17。由于細(xì)胞破碎的過(guò)程中蛋白水解酶也會(huì)被釋放出來(lái)，因此需要考慮這些蛋白水解酶在實(shí)驗(yàn)過(guò)程，尤其是長(zhǎng)時(shí)間的透析中對(duì)于提取所得蛋白的影響。蛋白水解酶的分子量一般在20kD-30kD左右，相關(guān)文獻(xiàn)中酵母內(nèi)所含的蛋白水解酶的分子量也均未超過(guò)100kD，理論上不會(huì)在透析袋內(nèi)停留太久，因此認(rèn)為其影響時(shí)間較短。由于所學(xué)知識(shí)有限，僅對(duì)上述三類蛋白水解酶進(jìn)行進(jìn)一步分析。膠原酶能辨識(shí)并剪切Pro-X-Gly-Pro多肽序列，而此序列在胞外基質(zhì)主成分-膠原蛋白中出現(xiàn)的頻率比一般蛋白高很多，使得膠原酶能較專一的作用在胞外基質(zhì)上。因此可認(rèn)為膠原酶對(duì)于蔗糖酶無(wú)降解作用，并且能夠清除酵母全蛋白提取液中膠原蛋白類的雜蛋白。Caspase家族與Mca1通常與細(xì)胞凋亡程序性細(xì)胞死亡（programmedcelldeath，PCD）的調(diào)控緊密相關(guān)，且使用酵母作為研究細(xì)胞凋亡模式生物的研究也較為成熟18，部分文獻(xiàn)19-22也表明Caspase與Mca1通常對(duì)細(xì)胞的壽命具有積極影響，通過(guò)參與細(xì)胞的蛋白質(zhì)質(zhì)控（proteinqualitycontrol，PQC）等途徑維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)。在研磨和提純過(guò)程中，酵母或許會(huì)因?yàn)樯姝h(huán)境的變化而較多表達(dá)Caspase系列蛋白酶，但未見(jiàn)其對(duì)于蔗糖酶活性的直接影響。結(jié)合酵母全蛋白提取與確認(rèn)的相關(guān)研究，我們認(rèn)為，在透析過(guò)程中上述三類蛋白酶不會(huì)對(duì)蔗糖酶的活性造成負(fù)面影響。若實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蝽樌瓿刹⑦M(jìn)行了SDS電泳，后續(xù)才能夠針對(duì)100kD以下蛋白的含量、分布及其出現(xiàn)的原因進(jìn)行更深入的分析。參考文獻(xiàn)[1]李楠,莊蘇星,丁益.酵母蔗糖酶的提取方法[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào),2007,26(4):83-87.[2]梁敏,李楠楠,鄒東恢.蔗糖酶的提取工藝及性質(zhì)研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,49(9):2218-2220.[3]方芳,趙華,咸漠,劉輝.釀酒酵母全蛋白的提取[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2014,40(09):180-184.DOI:10.13995/ki.11-1802/ts.2014.09.057.[4]吳娜.酵母蔗糖酶的分離純化[J].中國(guó)化工貿(mào)易,2015(14):271-271.[5]許培雅,邱樂(lè)泉.離子交換層析純化蔗糖酶實(shí)驗(yàn)方法改進(jìn)研究[J].實(shí)驗(yàn)室研究與探索,2002,21(3):82-84.[6]PicottiP,Clément-ZizaM,LamH,CampbellDS,SchmidtA,DeutschEW,R?stH,SunZ,RinnerO,ReiterL,ShenQ,MichaelsonJJ,FreiA,AlbertiS,KusebauchU,WollscheidB,MoritzRL,BeyerA,AebersoldR.Acompletemass-spectrometricmapoftheyeastproteomeappliedtoquantitativetraitanalysis.Nature.2013Feb14;494(7436):266-70.doi:10.1038/nature11835.[7]GaoY,PingL,DuongD,ZhangC,DammerEB,LiY,ChenP,ChangL,GaoH,WuJ,XuP.Mass-Spectrometry-BasedNear-CompleteDraftoftheSaccharomycescerevisiaeProteome.JProteomeRes.2021Feb5;20(2):1328-1340.doi:10.1021/acs.jproteome.0c00721.[8]ZhuH,BilginM,SnyderM.Proteomics.AnnuRevBiochem.2003;72:783-812.doi:10.1146/annurev.biochem.72.121801.161511.[9]Krogan,N.,Cagney,G.,Yu,H.etal.GloballandscapeofproteincomplexesintheyeastSaccharomycescerevisiae.Nature440,637–643(2006)./10.1038/nature04670[10]RuiChen,MichaelSnyder,Yeastproteomicsandproteinmicroarrays,JournalofProteomics,Volume73,Issue11,2010,Pages2147-2157,ISSN1874-3919,/10.1016/j.jprot.2010.08.003.[11]XiaoH,LiuX,FengY,ZhengL,ZhaoM,HuangM.SecretionofcollagenasesbySaccharomycescerevisiaeforcollagendegradation.BiotechnolBiofuelsBioprod.2022Aug28;15(1):89.doi:10.1186/s13068-022-02186-y.PMID:36031598;PMCID:PMC9420286.[12]RotheS,PrakashA,TyedmersJ.TheInsolubleProteinDeposit(IPOD)inYeast.FrontMolNeurosci.2018Jul12;11:237.doi:10.3389/fnmol.2018.00237.PMID:30050408;PMCID:PMC6052365.[13]陳光,趙秋霞,盛美田.一種酵母活性蛋白酶:,CN104560923A[P].2015.[14]FahrenkrogB.Nma111p,thepro-apoptoticHtrA-likenuclearserineproteaseinSaccharomycescerevisiae:ashortsurvey.BiochemSocTrans.2011Oct;39(5):1499-501.doi:10.1042/BST0391499.PMID:21936841.[15]GazdaLD,JoónéMatúzK,NagyT,MótyánJA,T?zsérJ.BiochemicalcharacterizationofTy1retrotransposonprotease.PLoSOne.2020Jan9;15(1):e0227062.doi:10.1371/journal.pone.0227062.PMID:31917798;PMCID:PMC6952103.[16]SvobodaM,KonvalinkaJ,TrempeJF,GrantzSaskovaK.TheyeastproteasesDdi1andWss1arebothinvolvedintheDNAreplicationstressresponse.DNARepair(Amst).2019Aug;80:45-51.doi:10.1016/j.dnarep.2019.06.008.Epub2019Jun27.PMID:31276951.[17]BaskervilleC,SegalM,ReedSI.Theproteaseactivityofyeastseparase(esp1)isrequiredforanaphasespindleelongationindependentlyofitsroleincleavageofcohesin.Genetics.2008Apr;178(4):2361-72.doi:10.1534/genetics.107.085308.PMID:18430955;PMCID:PMC2323821.