磺胺多殘留檢測試劑盒使用說明書

第第頁磺胺多殘留檢測試劑盒使用說明書磺胺多殘留檢測試劑盒使用說明書（酶聯(lián)免疫法）1原理及用途本試劑盒采納間接競爭ELISA方法檢測組織、血清、蜂蜜、牛奶、尿液、雞蛋等樣本中的磺胺類藥物（Sulfonamides，SAs），試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標板、酶標記物、抗體、標準品及其他配套試劑構(gòu)成。檢測時，加入標準品或樣品溶液，樣本中的磺胺類藥物和酶標板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競爭抗磺胺類藥物抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含磺胺類藥物含量成負相關(guān)，與標準曲線比較即可得出樣本中磺胺類藥物的殘留量。2技術(shù)指標2.1試劑盒靈敏度：0.5ppb（ng/ml）2.2反應(yīng)模式：25℃，45min～15min2.3檢測下限：組織（高檢測限方法）0.5ppb組織（低檢測限方法）2.5ppb血清、尿液、雞蛋2ppb蜂蜜0.5ppb牛奶10ppb水樣1ppb2.4交叉反應(yīng)率：藥物名稱交叉率靈敏度ppb磺胺二甲基嘧啶（SM2）100%0.5磺胺間甲氧嘧啶（SMM）670%0.07磺胺對甲氧嘧啶（SMD）582%0.09磺胺鄰二甲氧嘧啶（SDM）451%0.1磺胺甲基嘧啶（SM1）313%0.15磺胺嘧啶（SD或SDZ）308%0.15磺胺二甲異嘧啶（SM2）241%0.2磺胺間二甲氧嘧啶（SDM）175%0.3磺胺甲噻二唑（SMT）165%0.3磺胺氯吡嗪（Esb3）67%0.8磺胺噻唑（ST）58%0.9磺胺氯噠嗪（SCPA）58%0.9磺胺甲氧噠嗪（SMP）57%0.9磺胺喹噁啉（SQX）42%1磺胺異噁唑（SIZ）18%3磺胺甲噁唑（SMZ）18%32.5樣本回收率：組織、蜂蜜、水樣9525%尿樣、牛奶、血清8525%雞蛋9025%3試劑盒構(gòu)成酶標板96孔標準液：各1ml0ppb、0.5ppb、1.5ppb、4.5ppb、13.5ppb、40.5ppb高標準液（紅蓋）：1ppm1ml酶標記物（紅蓋）5.5ml抗體工作液（藍蓋）5.5ml底物液A（白蓋）6ml底物液B（黑蓋）6ml停止液（黃蓋）6ml20×濃縮洗滌液（白蓋）40ml2×復(fù)溶液（黃蓋）50ml說明書1份蓋板膜1張自封袋1個4需要的器材和試劑4.1儀器：酶標儀、打印機、均質(zhì)器、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）4.2微量移液器：單道20？l200？l，100？l1000？l、多道300？l4.3試劑：乙酸乙酯、正己烷、乙腈、Na2HPO4·12H2O、NaOH、濃HCL、NaH2PO4·2H2O5樣本前處理5.1樣本處理前須知：試驗器具必需干凈并使用一次性吸頭，以避開污染干擾試驗結(jié)果。5.2配液：配液1：0.2MNaOH溶液稱取0.8gNaOH加去離子水混勻溶解，定容至100ml。配液2：0.02MPB緩沖液稱取2.58gNa2HPO4·12H2O和0.44gNaH2PO4·2H2O加去離子水混勻溶解，定容至500ml。配液3：0.5M鹽酸溶液4.3ml濃HCL加入去離子水混勻，定容至100ml。配液4：復(fù)溶液（注：若檢測樣本為水樣則勿配此液）將2×復(fù)溶液用去離子水2倍稀釋（1份復(fù)溶液加1份去離子水），用于樣本的復(fù)溶，復(fù)溶液在4℃環(huán)境可保存一個月。配液5:工作洗滌液將濃縮洗滌液20倍稀釋（1份洗滌液加19份去離子水）。5.3樣本前處理步驟：5.3.1組織樣本（高檢測限）處理方法1）稱取30.05g均質(zhì)組織樣本置離心管中，加入3ml0.02MPB緩沖液充分振蕩混勻，再加入4ml乙酸乙酯和2ml乙腈，充分振蕩10min，于4000r/min以上速度離心10min；2）移取2ml上層液體（約相當(dāng)于1g的樣本）在5060℃氮氣或空氣吹干；3）加1ml正己烷溶解干燥的殘留物，再加1ml復(fù)溶液，猛烈振蕩1min，4000r/min，離心5min；4）除去上層正己烷，取下層水相50？l用于分析。樣本稀釋倍數(shù)：1檢測下限：0.5ppb5.3.2組織樣本（低檢測限）處理方法1）稱2.00.05g均質(zhì)組織樣本于離心管中；加入8ml0.02MPB緩沖液，震蕩2min，4000r/min以上離心10min；2）取50？l液體用于分析。樣本稀釋倍數(shù):5檢測下限：2.5ppb5.3.3血清樣本處理方法1）將血樣本于室溫放置30min，于4000r/min以上離心10min，分別出血清或過濾血清；2）取1ml血清，加入3ml0.02MPB緩沖液混合，混合30s；3）取50？l用于分析。樣本稀釋倍數(shù)：4檢測下限：2ppb??5.3.4蜂蜜樣本處理方法1）稱取10.05g蜂蜜樣本于50ml離心管中，加入1ml0.5M鹽酸置于37℃環(huán)境中30min；2）加入2.5ml0.2M氫氧化鈉（將PH值調(diào)至5左右）再加入4ml乙酸乙脂振蕩5min，4000r/min以上室溫離心10min；3）取2ml上層液體于5060℃下氮氣吹干，加0.5ml已稀釋好的復(fù)溶液復(fù)溶，混合30s；4）取50？l用于分析。樣本稀釋倍數(shù)：1檢測下限：0.5ppb5.3.5尿樣本處理方法1）用3ml0.02MPB緩沖液與1ml經(jīng)離心后的清亮尿樣本混合，混合30s；2）取50？l液體用于分析。樣本稀釋倍數(shù):4檢測下限：2ppb5.3.6牛奶樣本處理方法1）將牛奶樣本用0.02MPB緩沖液20倍稀釋（如20？l牛奶+380？l0.02MPB緩沖液），混合30s；2）取50？l用于分析。樣本稀釋倍數(shù)：20檢測下限：10ppb5.3.7水樣處理方法1）取水樣200ul加入200ul2X復(fù)溶液，混合30s；2）取50？l用于分析。樣本稀釋倍數(shù)：2檢測下限：1ppb5.3.8雞蛋樣本處理方法1）用均質(zhì)器均質(zhì)雞蛋樣本，使蛋清和蛋黃充分混合；2）稱取2.00.05g均質(zhì)后的雞蛋樣本（蛋粉1g加3ml去離子水混勻后取2ml相當(dāng)于2g鮮雞蛋）至50ml離心管中，加入8ml乙腈，立刻用振蕩器振蕩10min，室溫4000r/min以上離心5min；3）移取2ml上清液至10ml干凈干燥玻璃試管中于，在5060℃氮氣或空氣吹干；4）加入1ml正己烷，用渦旋儀渦動30s溶解干燥的殘留物，再加入1ml復(fù)溶工作液，用渦旋儀渦動1min，室溫4000r/min以上離心5min；5）去上層有機相，取下層水相50ul用于分析。樣本稀釋倍數(shù):2檢測下限：1ppb6酶聯(lián)免疫試驗步驟將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30min以上,洗滌液冷藏時可能會有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于28℃。6.1編號：將樣本和標準品對應(yīng)微孔順次編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。6.2加樣反應(yīng)：加標準品或樣本50？l/孔到各自的微孔中，然后加酶標記物50？l/孔，再加入50？l/孔的抗體工作液，用蓋板膜封板，輕輕振蕩5秒混勻，25℃反應(yīng)45分鐘。6.3洗滌：當(dāng)心揭開蓋板膜，甩去孔內(nèi)液體，每孔加350ul工作洗滌液，靜置30秒后棄去，重復(fù)洗滌5次，最后一次拍干（用吸水紙拍干，拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。6.4顯色：每孔加入底物液A50？l，再加底物液B50？l，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光顯色15分鐘（若藍色過淺，可適當(dāng)延長反應(yīng)時間）。6.5終止：每孔加入停止液50？l，輕輕振蕩混勻，停止反應(yīng)。6.6測吸光值：用酶標儀于450nm處測定每孔吸光度值（建議用雙波長450/630nm）。測定應(yīng)在停止反應(yīng)后10分鐘內(nèi)完成。7結(jié)果分析7.1百分吸光率的計算標準液或樣本的百分吸光率等于標準液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標準液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即百分吸光度值（%）＝A×100%A0A標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值A(chǔ)00ppb標準溶液的平均吸光度值7.2標準曲線的繪制與計算以標準液百分吸光率為縱坐標，對應(yīng)的標準液濃度（ppb）的對數(shù)為橫坐標，繪制標準液的半對數(shù)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測物的實際濃度。若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的精準、快速分析。（歡迎來電索?。?注意事項8.1室溫低于25℃或試劑及樣本沒有回到室溫（25℃）會導(dǎo)致全部標準的OD值偏低。8.2在洗板過程中假如顯現(xiàn)板孔干燥的情況，則會顯現(xiàn)標準曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立刻進行下一步操作。8.3混合要均勻，洗板要徹di，在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性。8.4在全部孵育