基因的克隆與表達(dá)

基因的克隆與表達(dá)基因

基因(gene)這個(gè)名詞是1909年由遺傳學(xué)家約翰森(W.L.Johannsen,1857—1927)提出來的。他用基因這一名詞來表示遺傳的獨(dú)立單位,相當(dāng)于孟德爾在豌豆試驗(yàn)中提出的遺傳因子。顧名思義,基因不僅是一個(gè)遺傳物質(zhì)在上下代之間傳遞的基本單位,也是一個(gè)功能上的獨(dú)立單位。

基因是DNA分子上具有遺傳效應(yīng)的特定核苷酸序列的總稱，是具有遺傳效應(yīng)的DNA（脫氧核糖核酸）分子片段?；虿粌H可以通過復(fù)制把遺傳信息傳遞給下一代，還可以使遺傳信息得到表達(dá)，反映在蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)上，從而使后代表現(xiàn)出與親代相似的性狀。

1．結(jié)構(gòu)基因（structuralgene）是指某些能決定某種多肽鏈（蛋白質(zhì)）或酶分子結(jié)構(gòu)的基因。結(jié)構(gòu)基因的突變可導(dǎo)致特定蛋白質(zhì)（或酶）一級(jí)結(jié)構(gòu)的改變或影響蛋白質(zhì)（或酶）量的改變。2.調(diào)控基因（regulatorandcontrolgene）是指某些可調(diào)節(jié)控制結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的基因。調(diào)控基因的突變可以影響一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)基因的功能，或?qū)е乱粋€(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)（或酶）的改變。

簡(jiǎn)言之，基因就是編碼一段功能蛋白質(zhì)的DNA序列及其調(diào)控序列?？寺∈怯⑽模╟lon）clone的音譯：指通過無(wú)性繁殖過程所產(chǎn)生的與親代完全相同的子代群體。

無(wú)性繁殖是指不經(jīng)過雌雄兩性生殖細(xì)胞的結(jié)合、只由一個(gè)生物體產(chǎn)生后代的生殖方式，常見的有孢子生殖、出芽生殖和分裂生殖。由植物的根、莖、葉等經(jīng)過壓條或嫁接等方式產(chǎn)生新個(gè)體也叫無(wú)性繁殖。

克隆就是一種以DNA重組技術(shù)為基礎(chǔ)的人工誘導(dǎo)的無(wú)性繁殖方式。

也稱為分子克隆(molecularcloning)或基因克隆。DNA重組技術(shù)是在分子水平對(duì)基因進(jìn)行體外操作?？寺》?、切、接、轉(zhuǎn)、篩分、切、接、轉(zhuǎn)、篩分:目的基因的獲得1、PCR（RT-PCR）2、酶切PCR技術(shù)PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction），是指利用耐熱DNA聚合酶的反復(fù)作用，通過變性-復(fù)性-延伸的循環(huán)操作，在體外迅速將DNA模板擴(kuò)增數(shù)百萬(wàn)倍的一種操作技術(shù)。一、PCR基本原理：

變性-復(fù)性-延伸1．變性：通常采用加熱變性，即將模板DNA或延伸后的雙鏈DNA加熱到940C，使雙螺旋DNA解開成為單鏈。2．復(fù)性：通過降低反應(yīng)溫度至500C-650C，使兩種引物能與兩條解開的DNA互補(bǔ)鏈的3`端粘合，以提供DNA聚合酶催化聚合所需的3`-OH。3．延伸：將反應(yīng)溫度提高到約720C，在耐熱DNA聚合酶的催化下，根據(jù)模板DNA提供的堿基順序，合成兩條互補(bǔ)鏈，從而使模板DNA擴(kuò)增一倍。PCR技術(shù)特點(diǎn)1、高度的敏感性。2、高度的特異性。3、操作簡(jiǎn)便快速。4、樣品適用廣泛。5、有一定程度的單核苷酸錯(cuò)誤摻入。引物

要擴(kuò)增模板DNA，首先要設(shè)計(jì)兩條寡核苷酸引物，所謂引物，實(shí)際上就是兩段與待擴(kuò)增靶DNA序列互補(bǔ)的寡核苷酸片段，兩引物間距離決定擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度；兩引物的5’端決定擴(kuò)增產(chǎn)物的兩個(gè)5’末端位置。由此可見，引物是決定PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度、位置和結(jié)果的關(guān)鍵，引物設(shè)計(jì)也就更為重要。引物的設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)的必要條件是與引物互補(bǔ)的靶DNA序列必須是已知的，兩引物之間的序列未必清楚，這兩段已知序列一般為18～21個(gè)堿基，可以用DNA合成儀合成與其對(duì)應(yīng)互補(bǔ)的二條引物。

（1）引物長(zhǎng)度：18-21bp（2）（G+C）%含量：引物的組成應(yīng)均勻，盡量避免含有相同的堿基多聚體。兩個(gè)引物中（G+C）%含量一般以40%～60%為佳。（3）引物的結(jié)構(gòu)：無(wú)明顯的次級(jí)結(jié)構(gòu)（4）引物之間：不應(yīng)發(fā)生互補(bǔ)(5）引物3’端配對(duì)精確和嚴(yán)格1、dNTP:PCR常用的濃度為50～200μmol/L，不能低于10～15μmol/L。四種dNTP的濃度應(yīng)相同。2、緩沖液：10mMTris.HClpH8.3,50mMKCl,1.5mMMgCl2。3、模板DNA：純度與含量。4、反應(yīng)參數(shù)。PCR的影響因素1.變性--考慮酶的失活問題。一般為反應(yīng)開始時(shí)用95oC×2-5min，在后續(xù)循環(huán)中設(shè)為94oC×30s-1min;2.退火--退火溫度取決于引物的堿基組成、長(zhǎng)度及引物與模板的匹配程度，一般在Tm–20-25oC左右；時(shí)間一般為30s-2min；3.延伸—溫度一般為72oC；時(shí)間取決于待擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度。在通常情況下，Taq酶的延伸速率約為2kb/min，而pfu為1kb/min。4.在最后一個(gè)循環(huán)結(jié)束后，需再在72oC下延伸10min，以產(chǎn)物完整。

單、雙鏈DNA或RNA都可以作為PCR的樣品。若起始材料是RNA，須先通過逆轉(zhuǎn)錄得到第一條cDNA。為了保證反應(yīng)的特異性，還應(yīng)用ng級(jí)的克隆DNA，μg水平的單拷貝染色體DNA或102-105拷貝的待擴(kuò)增片段作為起始材料。模板可以是粗品，但不能混有任何蛋白酶、核酸酶、TaqDNA聚合酶抑制劑以及結(jié)合在DNA上的蛋白。模板的純度、含量測(cè)定260nm1OD雙鏈DNA50μg/ml單鏈DNA40μg/ml

OD

260nm/

OD280nm

≈1.8ddH2O37.60μL10×Buffer5μLdNTPmixture(2.5mM)4μL引物上(20pmol/μL)1μL引物下(20pmol/μL)1μL

MgCl2(25mM)4μL模板(102-105

拷貝)0.5μLDNAPolymerase0.4μL總體積50μL95℃變性處理3min94℃30S56℃30S72℃1min30個(gè)循環(huán)72℃延伸7minPCR產(chǎn)物純化從凝膠上盡量小的切下目的片段,放在一個(gè)干凈的EP管中，稱取凝膠的重量，并加入3倍體積的BufferS1(即100mg膠加300μLBufferS1)；盛膠EP管于50℃水浴10min，每2-3min搖動(dòng)一次，至膠徹底融化；溶液加入到吸附柱內(nèi)，13000rpm離心1min，棄去收集管中的液體；加入0.5mL的BufferW1洗滌DNA，13000rpm離心15sec；棄去收集管中的液體，再加入0.5mL的W1Buffer，靜置1min，13000rpm離心15sec；棄去收集管中的液體，13000rpm離心1min；把吸附柱放在一個(gè)干凈的EP管內(nèi)，在柱子膜中央加入30μLBufferT1,室溫放置1min,13000rpm離心1min。凝膠回收后的目的基因，各取5μL電泳檢測(cè)，并測(cè)定濃度以確定連接體系（此步必做）。分、切、接、轉(zhuǎn)、篩切：限制性核酸內(nèi)切酶酶切目的基因和載體。限制性核酸內(nèi)切酶的分類限制性內(nèi)切酶分為3種類型：I、Ⅱ、Ⅲ型。

I型RE：識(shí)別位點(diǎn)復(fù)雜，特異性差。通常在識(shí)別位點(diǎn)的400~7000bp范圍內(nèi)切割DNA。現(xiàn)已報(bào)道19種。Ⅲ型RE：切割位點(diǎn)靠近識(shí)別序列但較難預(yù)測(cè)。一般在25~27bp范圍內(nèi)切割?，F(xiàn)已報(bào)道4種。I、Ⅲ型RE酶同時(shí)具有限制(剪切)與修飾(甲基化)兩種功能和依賴ATP限制，切割DNA鏈的位置遠(yuǎn)離識(shí)別序列，因此I型和Ⅲ型酶在DNA重組技術(shù)中都不常用。Ⅱ型限制性內(nèi)切酶實(shí)際應(yīng)用價(jià)值最大：①

Ⅱ型酶只具有限制性活性，無(wú)甲基化修飾活性；②

對(duì)DNA的切割要求嚴(yán)格的序列作為靶位點(diǎn)，切割精確；③

此類酶作用時(shí)只需要Mg2+參與。無(wú)需ATP。

Ⅱ型RE酶：被分子生物學(xué)家廣泛研究應(yīng)用，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)600多種。Ⅱ型RE：MW=60KD的單鏈多肽，最適pH：6~8，NaCl有抑制作用，Mg2+激活，巰基有保護(hù)作用;熱不穩(wěn)定。作用特點(diǎn)

1.

有嚴(yán)格的識(shí)別、切割的DNA序列，并以內(nèi)切的方式水解雙鏈DNA分子中的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生的DNA片段5’端為P，3’端為OH。SpeI5’ACTAGT3’

3’TGATCA

5’SwaI5’ATTTAAAT3’

3’TAAATTTA

5’2.識(shí)別序列一般為4～6個(gè)堿基對(duì)，并以切割序列的正中作為軸心，成180°反向重復(fù)(invertedrepeat)。這種結(jié)構(gòu)也稱為回文結(jié)構(gòu)(palindrom)。MspI5’CCGG3’

3’GGCC

5’SbfI5’CCTGCAGG3’

3’GGACGTCC

5’3.

Ⅱ型酶切割靶序列的大小決定了切割DNA鏈后產(chǎn)生的DNA片段的長(zhǎng)短，即識(shí)別序列短，則DNA鏈中可能存在的切點(diǎn)多，產(chǎn)生DNA片段短；識(shí)別序列長(zhǎng)，則DNA鏈上存在的切點(diǎn)少，產(chǎn)生DNA片段長(zhǎng)。

4.切割后產(chǎn)生平端或粘性末端。平頭末端(bluntend)：即在識(shí)別序列的對(duì)稱軸上進(jìn)行切割。

MscI5’TGGCCA3’

3’ACCGGT

5’HpaI5’GTTAAC3’

3’CAATTG

5’粘性末端(cohesiveend)即在識(shí)別序列的兩個(gè)對(duì)稱點(diǎn)切開DNA雙鏈，產(chǎn)生末端帶有單鏈尾巴的切口。ClaI5’ATCGAT3’

3’TAGCTA

5’KpnI5’GGTACC3’

3’CCATGG

5’Hpy188I5’TCNGA3’

3’AGNCT

5’HgaI5’GACGC(N)53’

3’CTGCG(N)10

5’三類特殊性質(zhì)的Ⅱ型限制性內(nèi)切酶(1)同裂酶(isoschizomer)：

又稱異源同工酶，即從不同原核生物中分離出來的不同的Ⅱ型酶有相同的識(shí)別特點(diǎn)，但切割位點(diǎn)可以相同，也可以不同，例如SamI(CCC↓GGG)和XmaI(C↓CCGGG)(2)同尾酶(isocaudarmer)：

不同來源的酶其識(shí)別和切割序列有一定的相關(guān)性，作后能產(chǎn)生相同的粘性末端，例如BamHI(GGATCC)。同尾酶產(chǎn)生的DNA片段能通過粘性末端之間的互補(bǔ)作用而彼此連接起來，這在分子克隆中有一定的作用。但應(yīng)當(dāng)注意有時(shí)兩用種同尾酶產(chǎn)生的末端，重組后形成的序列再也不能被原來的任何一種同尾酶所識(shí)別。例如：同尾酶可用于克隆載體的改造和構(gòu)建中，用以消除某些限制酶切點(diǎn)，但如果要回收重組克隆中的插入片段時(shí)，則要慎重選擇適當(dāng)?shù)耐裁浮au3AIBamHIGATC GGATCCCTAG CCTAGG

SauI XhoIGTCGAC CTCGAGCAGCTG GAGCTC(3)可變酶：此種酶所識(shí)別DNA序列中的一個(gè)或幾個(gè)堿基是可變的，并且識(shí)別序列往往超過6個(gè)堿基對(duì)，例如BstpI識(shí)別序列為：GGTNACC，其中N為一可變堿基。RE識(shí)別序列呈反轉(zhuǎn)對(duì)稱結(jié)構(gòu)，可分為四種類型1.

回文結(jié)構(gòu)：（Palindrome）2.間斷回文結(jié)構(gòu)（interruptedPalindrome）如：BgI：5，GCCNNNNNGGC3，

3，CGGNNNNNCCG5，3.簡(jiǎn)并序列（degenerateｓｅｑｕｅｎｃｅ）又稱“松弛”特異識(shí)別，即識(shí)別位點(diǎn)中某些核苷酸可以被其他核苷酸替換。４.非回文結(jié)構(gòu)：HgaI5’GACGC(N)53’

3’CTGCG(N)10

5’

ＲＥ使用時(shí)的注意事項(xiàng)１.

要求較純的底物DNA。２.

Mg2+和Tris-HCI緩沖體系，并且大多數(shù)內(nèi)切酶活性pH范圍在7．2—7．6之間；３.同時(shí)反應(yīng)體系中不能含有酚、氯仿、乙醚、SDS以及大于10mmol／L的EDTA；４.

對(duì)離子強(qiáng)度的要求分為3個(gè)級(jí)別，高鹽(100mmol／LNaCl)，

中鹽(50mmol／LNaCl)，

低鹽(0～10mmol／LNaCl)。５.在酶反應(yīng)緩沖體系中均添加有二硫蘇糖醇或β-巰基乙醇，以穩(wěn)定酶活性防止氧化。６.在具體試驗(yàn)操作時(shí)應(yīng)在低溫或冰浴條件下完成。目的片段5μL（1μg）10×buffer(E)4μL10×BSA4μLBamHI1μL（10u） HindIII1μL（10u）ddH2O25μL37℃作用1h，取5μL進(jìn)行電泳檢測(cè)，其余的進(jìn)行凝膠回收后直接用于連接。

分、切、接、轉(zhuǎn)、篩

接：目的片段與載體的連接DNA連接酶催化雙鏈DNA中相鄰堿基的5’磷酸和3’羥基間磷酸二酯鍵形成的酶，稱為DNA連接酶(DNAligase)。DNA連接酶主要有兩種：T4噬菌體DNA連接酶大腸桿菌DNA連接酶T4噬菌體DNA連接酶T4DNA連接酶最早是從T4噬菌體感染的大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)并分離的，分子量68kDa。主要功能及用途

①

連接雙鏈DNA中一條鏈上的缺口催化Km=1.5pmol/L②

鏈間存在的互補(bǔ)粘性末端的DNA片段Km=0.6umol/L。（連接反應(yīng)通常在12—15℃下進(jìn)行）③

DNA分子間的平頭末端Km=50umol/L（平端的連接通常在室溫下進(jìn)行）有報(bào)道T4DNA連接酶可以用于RNA連接，但效率低。5×

T4DNAligasebuffer4μL外源DNA0.3pmol載體DNA0.03pmolT4DNALigase1μLddH2Oupto20μL23-26℃連接1h或16℃過夜連接產(chǎn)物馬上轉(zhuǎn)化

可多做幾個(gè)連接梯度，同時(shí)設(shè)立對(duì)照，如載體的雙酶切自連以檢測(cè)是否酶切完全，載體的單酶切產(chǎn)物連接以檢測(cè)連接體系和連接酶。外源DNA與載體DNA的摩爾比為3-10，連接效果較好。1:13:16:1目的片段：1kb25ng75ng150ng載體質(zhì)粒：4kb100ng100ng100ng

分、切、接、轉(zhuǎn)、篩轉(zhuǎn)：連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞。于1.5mL離心管中加入100μL感受態(tài)細(xì)胞，取10μL重組質(zhì)粒緩慢加入并且邊加邊攪拌，置冰浴30min、42℃90Sec、迅速冰浴3~5min，加入0.5mLLB培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)1h。每個(gè)抗性平板中加入200-300μL轉(zhuǎn)化菌，搖動(dòng)淌勻，自然表面干燥后，37℃培養(yǎng)12-16h。同時(shí)將連接對(duì)照組也轉(zhuǎn)化細(xì)胞，再設(shè)立對(duì)照：（1）質(zhì)粒+感受態(tài)細(xì)胞；（2）無(wú)菌水+感受態(tài)細(xì)胞。培養(yǎng)完畢后，從實(shí)驗(yàn)組中篩選出陽(yáng)性菌落。從37℃培養(yǎng)16-20小時(shí)的新鮮平板中挑取一個(gè)單菌落（直徑2-3mm），轉(zhuǎn)到一個(gè)含有100mlLB或LB培養(yǎng)基的1L燒瓶中。于37℃劇烈振搖培養(yǎng)約3小時(shí)（旋轉(zhuǎn)搖床，300轉(zhuǎn)/分）。為得到有效轉(zhuǎn)化，活細(xì)胞數(shù)不應(yīng)超過108細(xì)胞/ml，可每隔20-30分鐘測(cè)量OD600值來監(jiān)測(cè)培養(yǎng)物的生長(zhǎng)情況。

培養(yǎng)物冷卻至0℃；4℃用SorvallGS3轉(zhuǎn)頭以4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，以回收細(xì)胞；倒出培養(yǎng)液，將管倒置1分鐘以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡；以10ml用冰預(yù)冷的0.1mol/LCaCl2重懸每份沉淀，放置于冰浴上，于4℃以4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，以回收細(xì)胞；

倒出培養(yǎng)液，將管倒置1分鐘以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡；每50ml初始培養(yǎng)物用2ml用冰預(yù)冷的0.1mol/LCaCl2,重懸每份細(xì)胞沉淀；可將細(xì)胞分裝成小份，放于-70℃凍存。

熱擊法：42℃90Sec電擊法：1200mv-2400mv1-5ms分、切、接、轉(zhuǎn)、篩篩：篩選含有正確序列重組質(zhì)粒的細(xì)菌。

非轉(zhuǎn)化子（不含質(zhì)粒）連接產(chǎn)物

轉(zhuǎn)化入

不含外源基因的重組子受體細(xì)胞

轉(zhuǎn)化子（含質(zhì)粒）不含正確序列基因的重組子含外源基因的重組子

含正確序列基因的重組子

第1步

第2步

第3步第1步和第2步為遺傳表型篩選，屬被動(dòng)篩選過程，包括抗生素平板篩選、α互補(bǔ)篩選、插入表達(dá)篩選、噬菌斑篩選。第3步為主動(dòng)篩選鑒定過程，主要方法有菌落原位雜交鑒定、小劑量制備質(zhì)粒限制性內(nèi)切酶分析鑒定、PCR鑒定、DNA序列測(cè)定等。

根據(jù)遺傳表型篩選

1．抗生素平板篩選2．

互補(bǔ)篩選3．插入表達(dá)篩選4．噬菌斑篩選1．抗生素平板篩選大多數(shù)克隆載體均帶有抗生素抗性基因，常見的有抗氨芐青霉素基因(Ampr)、抗四環(huán)素基因(Tetr)、抗卡那霉素基因(Kanr)等。如果外源DNA片段插入載體的位點(diǎn)在抗藥性基因之外，不導(dǎo)致抗藥性基因的插入失活，仍能編碼抗藥性基因，這種含有重組子的轉(zhuǎn)化細(xì)胞能夠在含有相應(yīng)藥物的瓊脂平板上生長(zhǎng)成菌落。但是除陽(yáng)性重組子以外,自身環(huán)化的載體、未酶解完全的載體以及非目的基因插入載體形成的重組子均能轉(zhuǎn)化細(xì)胞而能生長(zhǎng)，故本法僅是陽(yáng)性重組子的初步篩選。

互補(bǔ)篩選

-半乳糖苷酶(

-galactosidase)是一種把乳糖分解成葡萄糖和半乳搪的酶，最常用的

-半乳糖酶基因來自大腸桿菌的Lac操縱子，它們使載體中帶有大腸桿菌Lac操縱子的調(diào)節(jié)序列和編碼

-半乳糖苷酶N末端146個(gè)氨基酶的序列。用異丙基-

-D-

硫代半乳糖苷(IPTG)可誘導(dǎo)這個(gè)氨基末端片段的合成，合成的片段能與宿主編碼的

-半乳糖苷酶缺陷型進(jìn)行基因內(nèi)互補(bǔ)，恢復(fù)該酶的活性，這一過程稱

-互補(bǔ)。

因此當(dāng)載體帶有LacZ調(diào)節(jié)序列和編碼

半乳糖苷酸N末端146個(gè)氨基酸的序列，而宿主中該部分序列缺陷、其他部分完整時(shí)，雖然宿主編碼的或質(zhì)粒編碼的片段本身都沒有活性，但它們互相協(xié)助則可在大腸桿菌內(nèi)形成一個(gè)具有酶活性的蛋白質(zhì)。故在誘導(dǎo)物IPTG存在下，細(xì)菌在含色素底物5-溴-4-氯-3-吲哚-

-D-半乳糖苷(X-gal)培養(yǎng)基的平板上可形成藍(lán)色菌落。當(dāng)在質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)中插入外源DNA時(shí)，可使

-半乳糖苷酶的氨基末端失活，從而不能進(jìn)行

互補(bǔ)，因此帶有重組質(zhì)粒的細(xì)菌產(chǎn)生白色菌落。插入表達(dá)篩選

有些載體設(shè)計(jì)時(shí)，在篩選標(biāo)志基因前面連接一段負(fù)調(diào)控序列，當(dāng)插入失活該負(fù)調(diào)控序列時(shí)，其下游的篩選標(biāo)志基因才能表達(dá)，如pTR262質(zhì)粒其Tetr基因上游存在CI基因的負(fù)調(diào)控序列，CI基因可以抑制Tetr基因的表達(dá)，當(dāng)外源DNA片段插入CI基因的HindⅢ或BglI位點(diǎn)時(shí)，Tetr基因阻礙解除而表達(dá)，陽(yáng)性重組子為Tetr表型，而質(zhì)粒本身為Tetr表型，故轉(zhuǎn)化細(xì)菌在Tetr平板中，只有含外源DNA插入片段的陽(yáng)性重阻子的轉(zhuǎn)化菌才能生長(zhǎng)成菌落。噬菌斑篩選

對(duì)于以λ噬菌體載體系統(tǒng)，外源DNA插入λ噬菌體載體后，重組DNA分子大小必須在野生型λDNA長(zhǎng)度的78％～105％范圍內(nèi)，才能在體外包裝成具有感染活力的噬菌體顆粒，感染細(xì)菌后，形成清晰的噬菌斑。沒有外源DNA片段插入的載體不能包裝成噬菌體顆粒，不能感染細(xì)胞并形成噬菌斑，從而達(dá)到初步篩選的作用。

應(yīng)用限制性內(nèi)切酶酶切分析篩選對(duì)于初步篩選鑒定具有重組子的菌落，應(yīng)小量培養(yǎng)后，再分離出重組質(zhì)?；蛑亟M噬菌體DNA，用相應(yīng)的內(nèi)切酶(1種或2種)切割重組子釋放出插入片段，對(duì)于可能存在雙向插入的重組子還要內(nèi)切酶消化鑒定插入方向，然后凝膠電泳檢測(cè)插入片段和載體的大小。

MarkerDNA空載體單酶切重組質(zhì)粒單酶切重組質(zhì)粒雙酶切以重組質(zhì)粒為模板的PCR（目的片段）

菌落原位雜交技術(shù)迄先將轉(zhuǎn)化菌直接鋪在硝酸纖維素薄膜或瓊脂平板上，再轉(zhuǎn)移至另一硝酸纖維素薄膜上，用核素標(biāo)記的特異DNA或RNA探針進(jìn)行分子雜交，然后挑選陽(yáng)性克隆菌落。本方法能進(jìn)行大規(guī)模操作，一次可篩選5×105～5×106個(gè)菌落或噬菌斑，對(duì)于從基因文庫(kù)中挑選目的重組子，是一項(xiàng)首選的方法。核酸探針篩選為了進(jìn)一步確定DNA插入片段的正確性，在內(nèi)切酶消化重組子凝膠電泳分離后，通過Southern印跡轉(zhuǎn)移將DNA移至硝酸纖維膜上，再用放射性核素或非放射性標(biāo)記的相應(yīng)外源DNA片段作為探針，進(jìn)行分子雜交，鑒定重組于中的插入片段是否是所需的靶基因片段。

PCR篩選PCR技術(shù)具有高度的靈敏度和特異性，能在極短的時(shí)間內(nèi)將目的基因擴(kuò)增至數(shù)百萬(wàn)倍，通過電泳，可直接觀察到產(chǎn)物的存在。

一些載體的外源DNA插入位點(diǎn)兩側(cè)，存在恒定的序列，通過與插入片段兩側(cè)的SP6及T7啟動(dòng)子互補(bǔ)的引物，對(duì)小量抽提的質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR分析，不但可迅速擴(kuò)增插入片段，而且可以直接進(jìn)行DNA序列分析。對(duì)于原核或真核系統(tǒng)表達(dá)型重組子，其插入片段的序列正確性是非常關(guān)鍵的，故有必要對(duì)重組子進(jìn)行序列測(cè)定。也可利用已知的外源DNA的核酸序列，設(shè)計(jì)特異的引物直接用PCR進(jìn)行擴(kuò)增，并檢測(cè)產(chǎn)物。

檢測(cè)陽(yáng)性的重組質(zhì)粒送出測(cè)序；序列比對(duì)。Sequence01ATGATTAAATTAAAATTTGGTGTTTTTTTTACAGTTTTACTATCTTCAGCATATGCACATGG62Sequence11ATGATTAAATTAAAATTTGGTGTTTTTTTTACAGTTTTACTATCTTCAGCATATGCACATGG62

Sequence063AACACCTCAAAATATTACTGATTTGTGTGCAGAATACCACAACACACAAATACATACGCTAA124Sequence163AACACCTCAAAATATTACTGATTTGTGTGCAGAATACCACAACACACAAATACATACGCTAA124

Sequence0125ATGATAAGATATTTTCGTATACAGAATCTCTAGCTGGAAAAAGAGAGATGGCTATCATTACT186Sequence1125ATGATAAGATATTTTCGTATACAGAATCTCTAGCTGGAAAAAGAGAGATGGCTATCATTACT186

Sequence0187TTTAAGAATGGTGCAACTTTTCAAGTAGAAGTACCAGGTAGTCAACATATAGATTCACAAAA248Sequence1187TTTAAGAATGGTGCAACTTTTCAAGTAGAAGTACCAGGTAGTCAACATATAGATTCACAAAA248

Sequence0249AAAAGCGATTGAAAGGATGAAGGATACCCTGAGGATTGCATATCTTACTGAAGCTAAAGTCG310Sequence1249AAAAGCGATTGACAGGATGAAGGATACCCTGAGGATTGCATATCTTACTGAAGCTAAAGTCG310

Sequence0311AAAAGTTATGTGTATGGAATAATAAAACGCCTCATGCGATTGCCGCAATTAGTATGGCAAAT372Sequence1311AAAAGTTATGTGTATGGAATAATAAAACGCCTCATGCGATTGCCGCAATTAGTATGGCAAAT372

Sequence0373TAA375Sequence1373TAA375

Sequence01MIKLKFGVFFTVLLSSAYAHGTPQNITDLCAEYHNTQIHTLNDKIFSYTESLAGKREMAIIT62Sequence11MIKLKFGVFFTVLLSSAYAHGTPQNITDLCAEYHNTQIHTLNDKIFSYTESLAGKREMAIIT62

Sequence063FKNGATFQVEVPGSQHIDSQKKAIERMKDTLRIAYLTEAKVEKLCVWNNKTPHAIAAISMAN124Sequence163FKNGATFQVEVPGSQHIDSQKKAIDRMKDTLRIAYLTEAKVEKLCVWNNKTPHAIAAISMAN124

克隆基因的表達(dá)克隆的基因只有通過表達(dá)才能探索和研究基因的功能以及基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)理，克隆基因表達(dá)出所編碼的蛋白質(zhì)可供作結(jié)構(gòu)與功能的研究。有些具有特定生物活性的蛋白質(zhì)在醫(yī)學(xué)上、以至在工業(yè)上都是很有應(yīng)用價(jià)值的，可以克隆其基因使之在宿主細(xì)胞中大量表達(dá)而獲得。體外表達(dá)：無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)

原核表達(dá)系統(tǒng)：大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)體內(nèi)表達(dá)：酵母表達(dá)系統(tǒng)

真核表達(dá)系統(tǒng)

昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)

哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)

動(dòng)物/植物表達(dá)系統(tǒng)（轉(zhuǎn)基因動(dòng)物/植物）

特點(diǎn)：產(chǎn)量高、生長(zhǎng)速度快、操作容易、成本低。

缺點(diǎn)：翻譯后加工修飾體系不完善：無(wú)糖基化、?；取?/p>

一般表達(dá)獲得的蛋白常常以變性狀態(tài)存在，不具有生物學(xué)活性。

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)目前較常用的表達(dá)載體是具有可誘導(dǎo)的T7啟動(dòng)子的表達(dá)載體，大部分蛋白均可獲得表達(dá)而且表達(dá)量較高，表達(dá)量可占細(xì)菌總蛋白的25％以上。T7－RNA聚合酶的活性高于大腸桿菌RNA聚合酶，它只識(shí)別自己的啟動(dòng)序列，不能啟動(dòng)大腸桿菌DNA的轉(zhuǎn)錄，對(duì)抑制大腸桿菌RNA聚合酶的抗生素如利福平有抗性，因而可在利福平存在的條件下，使目的基因得到大量擴(kuò)增。還有受溫度變化誘導(dǎo)的具有λ噬菌體PL啟動(dòng)子調(diào)控

的載體等。

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)常見的商業(yè)化表達(dá)系統(tǒng)有：1、pETsystemandpETBlue?

system（Novagen公司），是原核蛋白表達(dá)中應(yīng)用最多的系統(tǒng)。具有可溶性蛋白生產(chǎn)、二硫鍵形成、蛋白外運(yùn)和多肽生產(chǎn)等專用載體和宿主菌。目前共有包括40多種載體、15種不同宿主菌和配套齊全的用于有效檢測(cè)和純化目標(biāo)蛋白的相關(guān)產(chǎn)品。

2、pBAD表達(dá)系統(tǒng)（Invitrogen公司），可控制蛋白質(zhì)的生產(chǎn)水平低于其成為不溶性蛋白的域值。通過與硫氧還蛋白的融合來增加溶解度

3、QIAexpressExpressionSystem（Qiagen公司

）。外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)形式按表達(dá)蛋白的部位分：分泌表達(dá)；外周質(zhì)及膜上表達(dá)；胞內(nèi)表達(dá)。外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)形式在原核細(xì)胞中表達(dá)外源基因時(shí)，可產(chǎn)生融合型、非融合型。原則上應(yīng)能夠使外源基因表達(dá)效率高，蛋白質(zhì)產(chǎn)量高，不易被細(xì)菌分解，而且產(chǎn)物易被提取、純化。

融合基因的表達(dá)外源基因在大腸桿菌中表達(dá)的一種簡(jiǎn)便方法是使其表達(dá)為融合蛋白，也就是說要表達(dá)的外源基因連接在一段原核基因的下游，蛋白質(zhì)的N末端由原核DNA序列或其他DNA序列編碼，C端由外源DNA的完整序列編碼，這樣的蛋白質(zhì)由1條短的原核多肽或具有其他功能的多肽和外源蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，故稱為融合蛋白。融合蛋白的特點(diǎn)①轉(zhuǎn)錄和翻譯起始從正常的大腸桿菌序列開始，故通?？梢援a(chǎn)生高水平的融合蛋白；②融合蛋白往往比天然的外源蛋白更加穩(wěn)定；③產(chǎn)生的融合蛋白較大，容易從蛋白質(zhì)凝膠電泳中區(qū)別出夾，而且融合蛋白帶可以從凝膠上切下，經(jīng)冷凍于燥，磨成粉末后即可作為抗原；④有些融合蛋白帶有信號(hào)肽，可以分泌到細(xì)胞外。這有助于蛋白質(zhì)的分離和純化。融合方式6×HisTag融合半乳糖苷酶融合

trpE融合蛋白

谷胱甘肽S－轉(zhuǎn)移酶（GST）融合

硫氧還蛋白（Trx）融合

麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）融合

堿性磷酸酶（phoA）啟動(dòng)子和信號(hào)序列

融合表達(dá)的蛋白，在分離純化過程中往往需要去除表達(dá)時(shí)額外引入的融合片段。因此需要用不同方法將其裂解，通常有：1、化學(xué)裂解法：特異識(shí)別特定的氨基酸殘基或一組氨基酸殘基。但化學(xué)裂解法裂解位點(diǎn)的特異性低，有時(shí)可能對(duì)目標(biāo)蛋白產(chǎn)生不必要修飾。

2、酶解法：反應(yīng)條件溫和，具有高度的特異性。常用的酶有Xa因子、凝血酶、腸激酶、凝乳酶、膠原酶等。但酶解法成本高

，反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，更重要的是蛋白酶本身不可避免地混入目標(biāo)蛋白中，造成新的污染，提高純化的復(fù)雜性。

3、IMPACT系統(tǒng)(inteinmediatedpurificationwithanaffinitychitin-bindingTag)該系統(tǒng)是由枯草桿菌來源的幾丁質(zhì)結(jié)合域（5kD，chitinbindingdomain，用于親和純化）和酵母蛋白質(zhì)剪接元件

intein組成一個(gè)雙效的融合標(biāo)簽。

intein在較低的溫度和還原條件下發(fā)生自身介導(dǎo)的N端裂解，釋放出與之相連的目的蛋白。因此融合蛋白無(wú)需蛋白酶裂解即可實(shí)現(xiàn)目的蛋白與fusiontag的精確切割。但含有較多二硫鍵的蛋白不適合這一系統(tǒng)。

分泌型表達(dá)為減少所需蛋白質(zhì)在宿主體內(nèi)被蛋白酶降解?；蛘呤沟鞍踪|(zhì)能夠在體外正確折疊和便于提純，經(jīng)常需要將被表達(dá)的蛋白質(zhì)分泌到細(xì)胞外，因此要用分泌型載體。分泌型載體的優(yōu)點(diǎn)①一些在胞內(nèi)被蛋白酶降解的蛋白質(zhì)在細(xì)胞周質(zhì)中很穩(wěn)定；②一些在胞內(nèi)無(wú)活性的蛋白質(zhì)在分泌后便具有活性，分泌可能使蛋白質(zhì)能夠正確折疊；③產(chǎn)生的蛋白質(zhì)沒有氨基末端甲硫氨酸，因?yàn)榍懈钗稽c(diǎn)在信號(hào)肽與編碼序列之間，甲硫氨酸會(huì)影響許多蛋白質(zhì)的活性。蛋白質(zhì)能夠在大腸桿菌中進(jìn)行分泌，至少要具備3個(gè)要素：①有一段信號(hào)肽；②在成熟蛋白質(zhì)內(nèi)有適當(dāng)?shù)呐c分泌相關(guān)的氨基酸序列；③細(xì)胞內(nèi)有相應(yīng)的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。信號(hào)肽長(zhǎng)度一般為15—30個(gè)氨基酸殘基。真核生物和原核生物的信號(hào)肽在結(jié)構(gòu)上都有以下特征：①信號(hào)肽一般都不長(zhǎng)，在氨基末端有一段帶正電荷的氨基酸序列，往往是精氨酸或賴氨酸殘基，其數(shù)目為1—3個(gè)；②有一個(gè)高度疏水的核心區(qū)，含亮氨酸或異亮氨酸殘基，位置可以從帶正電荷的氨基酸延伸到含切割位點(diǎn)的區(qū)域；③含有能被信號(hào)肽酶水解的切割位點(diǎn)，這個(gè)位點(diǎn)常常在丙氨酸之后，有的是在甘氨酸或絲氨酸之后。分泌型載體也有缺點(diǎn)，例如目的蛋白質(zhì)的產(chǎn)量往往很低，以及信號(hào)肽不能被切除或切在錯(cuò)誤位置上等。非融合蛋白的表達(dá)指在細(xì)菌內(nèi)表達(dá)的蛋白質(zhì)以真核蛋白質(zhì)mRNA的AUG為起始，在其氨基端不含任何細(xì)菌多肽序列。優(yōu)點(diǎn)：表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)功能接近于生物體內(nèi)天然蛋白質(zhì)。缺點(diǎn)：容易被細(xì)菌蛋白酶破壞。包含體（包涵體）表達(dá)的蛋白質(zhì)經(jīng)常是不溶的，會(huì)在細(xì)菌內(nèi)與細(xì)菌雜蛋白、核酸等成分形成不溶性聚合體即包含體（inclusionbody），尤其當(dāng)表達(dá)目的蛋白量超過細(xì)菌體總蛋白量10%時(shí)，就很容易形成包涵體。生成包涵體的原因可能有是蛋白質(zhì)合成快速太快，多肽鏈相互纏繞，缺乏使多肽鏈正確折疊的因素，導(dǎo)致疏水基因外露等。包含體的形成有利于防止蛋白酶對(duì)表達(dá)蛋白的降解，并且非常有利于分離表達(dá)產(chǎn)物。但包含體形成后，表達(dá)蛋白不具有生物活性，因此必須溶解包含體并對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行復(fù)性。包含體的制備可通過常規(guī)方法如超聲波、勻漿等使菌體破碎后，離心就可得到。密度梯度離心后則可得到高純度的包含體。包含體通常不溶于水，加入強(qiáng)蛋白質(zhì)變性劑后方可溶解。根據(jù)包含體中蛋白質(zhì)種類的不同，通常用6—8mol／L鹽酸胍或9～10mol／L尿素溶解包含體。采用pH2．0～4．5的酸性溶液也可使包含體溶解。形成包含體的表達(dá)蛋白恢復(fù)其活性的過程稱為包含體蛋白質(zhì)復(fù)性，其基本原理是隨著變性劑濃度的降低，表達(dá)蛋白恢復(fù)其天然構(gòu)型。常用的復(fù)性方法有逐步稀釋法或透析法等。酵母表達(dá)系統(tǒng)1、基因背景了解清楚，上游操作簡(jiǎn)單，生長(zhǎng)迅速，非常適于大規(guī)模發(fā)酵。2、具有一定的加工及修飾能力：如二硫鍵的正確形成，前體蛋白的水解加工。表達(dá)產(chǎn)物與天然蛋白相同或類似。3、可將異源蛋白基因與N-末端前導(dǎo)肽等信號(hào)肽融合，指導(dǎo)新生肽的分泌，在分泌中可對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行糖基化修飾，但其修飾糖鏈與高等真核細(xì)胞并不相同。

4、可移去起始甲硫氨酸，避免了作為藥物使用可能引起的免疫反應(yīng)問題。

缺點(diǎn)：產(chǎn)糖量過多因而損壞蛋白質(zhì)的生物活性、安全性等；糖基化修飾與高等真核細(xì)胞并不相同。

載體：均為大腸桿菌和酵母菌的“穿梭”質(zhì)粒。有附加體型載體和整合體型載體兩種。常用啟動(dòng)子：GAL1、AOX1、AUG1、TEF1等。酵母表達(dá)系統(tǒng)載體有：1、整合型載體:導(dǎo)入酵母宿主細(xì)胞后與酵母細(xì)胞染色體基因組DNA整合，穩(wěn)定性高，但基因拷貝數(shù)低。

2、附加體型載體：在酵母宿主中拷貝數(shù)量大，但在傳代過程中易丟失，影響重組菌的穩(wěn)定性和表達(dá)量。

常見宿主有：釀酒酵母、裂殖酵母、克魯維酵母、巴氏畢赤酵母等。

釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)多為附加型載體，巴氏畢赤酵母，多形漢遜酵母表達(dá)系統(tǒng)為整合型載體。克魯維酵母表達(dá)系統(tǒng)則兼而有之。釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)缺乏強(qiáng)有力的啟動(dòng)子，分泌效率差，表達(dá)質(zhì)粒易于丟失。目前，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是應(yīng)用最廣泛的酵母表達(dá)系統(tǒng)。它以甲醇作為唯一的碳源。產(chǎn)量較高。翻譯后的加工更接近哺乳動(dòng)物

。如日本綠十字公司利用該系統(tǒng)可以達(dá)到公斤級(jí)水平的人血清白蛋白的生產(chǎn)。

商品化酵母表達(dá)系統(tǒng)有畢赤酵母（Pichia）系統(tǒng)

（invitrogen）和Saccharomyces釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)（invitrogen）。畢赤酵母系統(tǒng)重組蛋白表達(dá)量可高達(dá)12g/L，表達(dá)量最高。

昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)

昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)是以桿狀病毒為載體，昆蟲細(xì)胞為宿主的表達(dá)系統(tǒng)。

1、表達(dá)效率高。重組蛋白的表達(dá)水平最高可達(dá)到細(xì)胞總蛋白的50％。2、屬于真核表達(dá)系統(tǒng)。有糖基化作用、脂肪酸?；饔?、氨基末端乙?；饔靡约傲姿峄?，有利于表達(dá)產(chǎn)物形成天然的高級(jí)結(jié)構(gòu)，保持原有的生物活性與功能。3、桿狀病毒能容納較大的外源基因而不影響其本身的增殖。4、桿狀病毒屬于昆蟲病毒。具有高度特異的宿主范圍，對(duì)脊椎動(dòng)物和植物均無(wú)致病性。病毒重組因失去多角體保護(hù)，在自然界的生存能力很弱，因此比較安全。5、應(yīng)用晚期多角體蛋白基因啟動(dòng)子表達(dá)外源基因可表達(dá)毒性蛋白。

6、桿狀病毒表達(dá)載體通用性廣。可表達(dá)來自病毒、細(xì)菌、真菌、植物和動(dòng)物幾乎所有的蛋白，并且能表達(dá)帶有內(nèi)含子的外源基因。

7、重組桿狀病毒除在體外昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)外源基因外，還能感染昆蟲活體，在體內(nèi)高效表達(dá)外源蛋白。

宿主細(xì)胞生長(zhǎng)慢、

培養(yǎng)基昂貴、

含有免疫宿主蛋白、

桿狀病毒感染會(huì)導(dǎo)致宿主死亡、因此每一輪蛋白合成均需重新感染、昆蟲細(xì)胞內(nèi)的糖基化方式與脊椎動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的糖基化方式有一定的差異，其糖蛋白的糖鏈結(jié)構(gòu)多為簡(jiǎn)單的不分支結(jié)構(gòu)。

啟動(dòng)子采用多角體蛋白啟動(dòng)子。宿主細(xì)胞通常來源于雙翅目昆蟲，包括果蠅、蚊子。來源于草地夜蛾（Spodopterafrugiperda）的Sf9細(xì)胞系是最常用的宿主細(xì)胞。商品化系統(tǒng)：

BaculoDirect?

桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)（invitrogen），典型的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是利用大腸桿菌中位點(diǎn)特異的轉(zhuǎn)座或昆蟲細(xì)胞中的同源重組來產(chǎn)生重組桿狀病毒。

DES?-Drosophilaexpressionsystem結(jié)合了昆蟲細(xì)胞高表達(dá)水平和哺乳動(dòng)物細(xì)胞的穩(wěn)定表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)。

哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)

哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)是生產(chǎn)天然蛋白的理想表達(dá)系統(tǒng)，是目前應(yīng)用最廣泛的動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。其優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)都極其顯著。產(chǎn)物的抗原性、免疫原性和功能與天然蛋白質(zhì)最接近，糖基化等后加工最精確。一般會(huì)產(chǎn)生正確加工的、有活性的蛋白。但該表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)水平較低、培養(yǎng)基昂貴、生長(zhǎng)緩慢、含有過敏物質(zhì)等缺點(diǎn)在實(shí)際應(yīng)用過程中較難避免。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)通常用來生產(chǎn)用常規(guī)方法無(wú)法獲得的真核細(xì)胞蛋白。如EPO，TNF受體，基因工程單抗等。CHO（中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢）是目前重組糖蛋白生產(chǎn)的首選體系。

載體：1、病毒性載體系統(tǒng)，包括逆轉(zhuǎn)錄病毒載體及其它DNA病毒載體。

優(yōu)點(diǎn)：能夠高效導(dǎo)入外源基因。

缺點(diǎn)：包裝時(shí)對(duì)其基因組的長(zhǎng)度有嚴(yán)格的限制，插入外源基因一般較短。2、質(zhì)粒性載體系統(tǒng)。

優(yōu)點(diǎn)：適用于多種細(xì)胞；安全。

缺點(diǎn)：導(dǎo)入外源基因的效率不如逆轉(zhuǎn)錄病毒。

商品化系統(tǒng)：ViraPower?慢病毒表達(dá)系統(tǒng)，是第一次實(shí)現(xiàn)在不分裂的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行穩(wěn)定的高水平基因表達(dá)。Adeno-X?

表達(dá)系統(tǒng)－最有效的腺病毒系統(tǒng)之一。BDAdeno-X?ExpressionSystem(Clontech)可以在2周內(nèi)獲得高效價(jià)的腺病毒，其效率遠(yuǎn)高于其他腺病毒系統(tǒng)。BDAdeno-X?Tet-On?&Adeno-X?Tet-Off?ExpressionSystems(Clontech)可表達(dá)毒性蛋白質(zhì)。BDRevTet-On?&RevTet-Off?GeneExpressionSystems(Clontech)表達(dá)效率高。

體外表達(dá)系統(tǒng)（無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)）體外翻譯系統(tǒng)又稱無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)，是一種相對(duì)胞內(nèi)表達(dá)系統(tǒng)而言的開放型表達(dá)系統(tǒng)。

優(yōu)點(diǎn)：內(nèi)源型mRNA干擾很小，操作程序簡(jiǎn)單，獲得重組蛋白周期很短。主要用于蛋白質(zhì)快速分析鑒定；基因轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控機(jī)理研究；分子間的相互作用的研究。

缺點(diǎn)：昂貴；操作要求高；表達(dá)量不夠高。1、兔網(wǎng)織紅細(xì)胞系統(tǒng)，由新西蘭大白兔制備。2、麥胚提取物系統(tǒng)，可穩(wěn)定地表達(dá)一些在兔網(wǎng)織紅細(xì)胞中翻譯受到抑制的DNA。

3、原核體外翻譯系統(tǒng)（S30原核體外翻譯系統(tǒng)），

E.coliS30提取物由OmpT內(nèi)切酶和Lon蛋白酶缺陷的E.coliB菌株制備，所以在S30系統(tǒng)中表達(dá)基因可以增加產(chǎn)物的穩(wěn)定性。目前多家公司有商業(yè)化產(chǎn)品，常見的有：RTSE.Coli系統(tǒng);RTS100wheatgermCECF系統(tǒng)(Roche)TNT?快速偶聯(lián)轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)(Promega)；GoldTNT?T7Express96系統(tǒng)（Promega），該系統(tǒng)有SP6和T7兩種類型，適合在96孔板上進(jìn)行大規(guī)模高通量篩選分析；TNT?T7QuickforPCRDNA(promega)，PCRDNA的TNT?T7快速系統(tǒng)從PCR反應(yīng)液中直接取樣，無(wú)需純化DNA，直接用于偶聯(lián)的轉(zhuǎn)錄/翻譯反應(yīng)；TNT?偶聯(lián)小麥胚芽抽提系統(tǒng)(promega)。。動(dòng)物/植物表達(dá)系統(tǒng)（轉(zhuǎn)基因動(dòng)物/植物）

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物指用人工方法將外源基因?qū)雱?dòng)物受精卵或早期胚胎細(xì)胞，使外源基因與動(dòng)物本身的基因組整合，并隨細(xì)胞的分裂而增殖，從而將外源基因穩(wěn)定的遺傳給下一代的工程化動(dòng)物。1981年，第一次成功地將外源基因?qū)雱?dòng)物胚胎，創(chuàng)立了轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物技術(shù)1982年獲得轉(zhuǎn)基因小鼠，目前已有轉(zhuǎn)基因兔、綿羊、豬、魚、昆蟲、牛、雞、山羊、大鼠等轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。

優(yōu)點(diǎn)：1、高效性。2、表達(dá)產(chǎn)物具有與高等動(dòng)物表達(dá)相一致的免疫原性和生物活性，表達(dá)產(chǎn)物可糖基化、酰胺化、磷酸化。3、來源廣，可進(jìn)行大量田間栽培，成本低。

抗蟲棉、彩色棉、抗蟲玉米、大豆等，都已進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化和商品化階段。

表達(dá)產(chǎn)物包括疫苗、抗體及其片斷、細(xì)胞因子、酶及其它藥用蛋白和生物活性肽等。

重組蛋白質(zhì)表達(dá)的基本程序包括：

1、目標(biāo)基因克隆入表達(dá)載體，獲得表達(dá)質(zhì)粒。

2、表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入宿主細(xì)胞。

3、目標(biāo)基因在宿主中的表達(dá)。

4、目標(biāo)蛋白的分離、純化。

重組表達(dá)系統(tǒng)一般包含表達(dá)載體和表達(dá)宿主。表達(dá)載體包含基因/外源DNA序列、表達(dá)載體、強(qiáng)啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)(SD序列)、終止子、選擇標(biāo)記、復(fù)制子等構(gòu)件。

克隆菌：

BL21、JM109表達(dá)菌：

BL21(DE3)、JM109(DE3)外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)1．重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化：重組質(zhì)粒各1

l，加入到100

l感受態(tài)大腸桿菌中，設(shè)空質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照和感受態(tài)大腸桿菌為陰性對(duì)照。37℃，培養(yǎng)16h。2．細(xì)菌擴(kuò)增：用無(wú)菌接種環(huán)從平板上挑取5個(gè)克隆，分別接種到3ml含50

g/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，并設(shè)陰性對(duì)照，300r/min振搖3hrs以上。3．誘導(dǎo)表達(dá)：當(dāng)振搖至OD值=0.4。每管菌液各取出1ml加入IPTG至終濃度為1mmol/L，另吸出1ml不加IPTG作對(duì)照。37℃，300r/min，培養(yǎng)4h。4℃，12000r/min離心1min，棄上清。每管加1mlPBS,混勻，同法離心。棄上清，每管加入50

lPBS、50

l2×loadingbuffer，重懸沉淀，100℃煮沸5min，置-20℃?zhèn)溆?。基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)Northern雜交檢測(cè)細(xì)胞中是否含有特定的mRNA，測(cè)定特定mRNA在總RNA中的比例，由此獲得目的mRNA的轉(zhuǎn)錄情況。斑點(diǎn)雜交用特異性探針檢查mRNA，并估計(jì)表達(dá)過程中mRNA的轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分析誘導(dǎo)前后細(xì)胞中目的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。如表達(dá)水平很低，可用同位素作為放射性標(biāo)記，如35S-甲硫氨酸或35S-半胱氨酸進(jìn)行代謝標(biāo)記，然后進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和放射自顯影，或在Western雜交中用特異性單克隆抗體或多克隆抗體分析目的蛋白質(zhì)存在與否及其含量。免疫學(xué)方法利用特異性抗體與目的蛋白質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)，經(jīng)免疫沉淀、ELISA等免疫學(xué)方法，檢測(cè)表達(dá)蛋白質(zhì)。例如，免疫沉淀法可用于檢測(cè)并定量分析多種蛋白質(zhì)混合物中的靶抗原。這種方法很敏感，可檢測(cè)出lOOpg的放射性標(biāo)記蛋白質(zhì)。當(dāng)與SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳并用時(shí)，即可用于分析外源基因在原核和真核宿主細(xì)胞中的表達(dá)情況放射性標(biāo)記靶蛋白的免疫沉淀以及其后的分析包括下列幾個(gè)步驟：①靶蛋白的放射性標(biāo)記；②裂解細(xì)胞；③特異性免疫復(fù)合物的形成；④免疫復(fù)合物的收集及純化；⑤放射性標(biāo)記蛋白質(zhì)的免疫沉淀分析。SDSSodiumDodecylSulfatePolyacrylamideGelElectrophoresis，SDS:鑒定蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量1．0.1mol/L磷酸鈉緩沖液（PBS）：1mol/LNa2HpO468.4ml1mol/LNaH2PO4

31.6ml。2.2×loadingbuffer：0.1MTris-HClpH6.8，4%SDS，20%Glycerol，0.2MDTT，0.2%BromophenolBlue。3.

Tris-甘氨酸緩沖液：25mmol/LTris,250mmol/L甘氨酸,0.1%SDS。4．聚丙烯酰胺(Acrylamide；，N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺(Bisacrylamide)；十二烷基硫酸鈉；N,N,N',N'-四甲基乙烯酰胺(TEMED；過硫酸胺；考馬斯亮藍(lán)R250。1．洗凈玻璃板，按說明書安裝電泳裝置。2．配膠：8%分離膠組分為：ddH2O2.3ml，30%Acrylamide1.3ml，1.5mol/LTris(pH8.8)1.3ml，10%SDS0.05ml，10%過硫酸氨0.05ml，TEMED0.004ml?；旌虾螅⑷胍寻惭b玻璃板的間隙中，上覆純水隔離空氣。5%積層膠5ml組份為：ddH2O3.4ml，30%Acrylamide0.83ml，1.0mol/LTris(pH6.8)0.63ml，10%SDS0.05ml，10%APS0.05ml，TEMED0.005ml。混合后，加入已凝聚的分離膠上，插入電泳梳子。3．凝膠電泳：分別將各樣品10

l加入凝膠梳孔中，留取一孔加入蛋白Marker10

l，空孔加入10

l1×loadingbuffer置于垂直電泳槽內(nèi)，向上下槽分別加入電泳緩沖液，56V穩(wěn)壓電泳至溴酚藍(lán)指示劑泳動(dòng)至積層膠與分離膠結(jié)合處（約20min左右），調(diào)整電壓至105V，電泳至指示劑泳動(dòng)至分離膠下端邊緣（約50min左右）停止電泳。4．染色：將5倍體積染色液考馬斯亮藍(lán)R250加入染色缸中，搖床輕搖1h，至凝膠全部著色。5．脫色：反復(fù)更換脫色液至本底透明，成像儀攝片。原理：抗原抗體反應(yīng)。酶聯(lián)抗體，底物顯色。WesternBlot:檢測(cè)蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)性質(zhì)譜檢測(cè)；兩端氨基酸測(cè)序；生物學(xué)活性測(cè)定。表達(dá)載體（expressionvector）要使克隆基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)，就要將它放入帶有基因表達(dá)所需要的各種元件的載體中，這種載體就稱為表達(dá)載體（expressionvector）。外源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)新霉素抗性選擇系統(tǒng)新霉素是細(xì)菌抗生素，它可以干擾原核生物的核糖體，使其蛋白質(zhì)合成不能正常進(jìn)行，而真核細(xì)胞核糖體則不受新霉索的影響。新霉素的一種類似物G418(geneticin)對(duì)真核細(xì)胞和原核細(xì)胞均有毒性。細(xì)菌的新霉素抗性基因(neor)能在真核細(xì)胞表達(dá)。neor基因編碼一種磷酸轉(zhuǎn)移酶，這種酶能使G418失活。所以，當(dāng)細(xì)胞表達(dá)了這種neo抗性基因后就會(huì)在含有G418的選擇培養(yǎng)基中存活，這種選擇系統(tǒng)適用于所有的細(xì)胞類型。外源基因?qū)氩溉閯?dòng)物細(xì)胞目的基因序列與載體連接后，要導(dǎo)入細(xì)胞中才能繁殖擴(kuò)增，再經(jīng)過篩選，才能獲得重組DNA分子克隆，不同的載體在不同的宿主細(xì)胞中繁殖，導(dǎo)入細(xì)胞的方法也不相同。

轉(zhuǎn)染方法（一）質(zhì)粒為載體的物理化學(xué)轉(zhuǎn)染法（二）以病毒為載體的生物學(xué)轉(zhuǎn)染法磷酸鈣法其利用的基本現(xiàn)象是：DNA如以磷酸鈣-DNA共沉淀物形式出現(xiàn)時(shí)，培養(yǎng)細(xì)胞攝取DNA的效率會(huì)顯著提高。用電穿孔法處理培養(yǎng)的哺乳類細(xì)胞也能提高細(xì)胞攝取DNA能力，但所用外加電場(chǎng)的強(qiáng)度、電脈沖的長(zhǎng)度等條件與處理細(xì)菌者都很不相同。脂質(zhì)體近年來用人工脂質(zhì)膜包裹DNA，形成的脂質(zhì)體（Liposome）可以通過與細(xì)胞膜融合而將DNA導(dǎo)入細(xì)胞，方法簡(jiǎn)單而有效，現(xiàn)有商售的脂質(zhì)體試劑，使用日益廣泛。

顯微注射法是在顯微鏡直視下，向細(xì)胞核內(nèi)直接注射外源基因，這種方法應(yīng)是有效的。但一次只能注射一個(gè)細(xì)胞，工作耗力費(fèi)時(shí)。電穿孔轉(zhuǎn)染法（electroporation）