羅非魚鏈球菌病防控技術(shù)

一、技術(shù)名稱羅非魚鏈球菌病防控技術(shù)二、技術(shù)概述該技術(shù)從"病原－宿主－綠色漁藥"三個方面進(jìn)行研究，建立了羅非魚鏈球菌病的高效復(fù)方中草藥免疫增強(qiáng)劑防控技術(shù)。在病原方面，對引起羅非魚鏈球菌病暴發(fā)性疾病的病原進(jìn)行了分離鑒定，確定該菌為無乳鏈球菌強(qiáng)毒株；進(jìn)而對無乳鏈球菌及ECP致病性、耐藥性、蛋白組學(xué)、全基因組和基因分型等生物學(xué)特征進(jìn)行了系統(tǒng)研究，建立了鏈球菌LAMP快速診斷技術(shù)；對無乳鏈球菌強(qiáng)毒株培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化；克隆了6個毒力蛋白基因并進(jìn)行了原核表達(dá)；構(gòu)建了PhoB基因缺失突變株和互補(bǔ)株并分析了突變株生物學(xué)特性，同時比較了野生株和突變株轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組圖譜；鑒定得到3條有效sRNA并獲取所有sRNA全長，構(gòu)建了sRNASAR-1缺失突變株及回補(bǔ)株并分析突變株生物學(xué)特性，同時比較野生株和突變株蛋白質(zhì)組學(xué)圖譜。在宿主方面，克隆了羅非魚9個免疫相關(guān)基因全長cDNA序列，并對其中4個基因進(jìn)行了原核表達(dá)，用表達(dá)蛋白制備了sIgM多抗并對羅非魚4個組織進(jìn)行了免疫組化分析；對滅活無乳鏈球菌誘導(dǎo)前后的羅非魚的免疫基因的組織分布差異以及在不同組織中的時間表達(dá)模式進(jìn)行了分析；通過構(gòu)建NCCRP-1胞外結(jié)合區(qū)域以及胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄活化區(qū)+信號轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)誘餌質(zhì)粒，從羅非魚肝臟和頭腎cDNA文庫中篩選出11個與NCCRP-1有潛在相互作用的蛋白，證實(shí)了NCCRP-1與C-typelectin、serotransferrin及CD28與CD80/86互作關(guān)系；對CD59的補(bǔ)體抑制活性、對革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁結(jié)合的主要組分進(jìn)行了研究。對中草藥當(dāng)歸、黃芪、板藍(lán)根、金銀花、甘草、山楂等10種常見中草藥按一定比例配制成A、B、C、D和E五種不同配方復(fù)方中草藥，通過測定羅非魚增重率、肌肉成分、血清生化指標(biāo)、血清免疫指標(biāo)、腸道菌群變化及對羅非魚抗無乳鏈球菌免疫保護(hù)力，從而篩選最佳配復(fù)方中草藥免疫增強(qiáng)劑；結(jié)果表明B配方的復(fù)方中草藥為最佳免疫增強(qiáng)劑，添加于羅非魚飼料進(jìn)行投喂后能有效提高羅非魚免疫指標(biāo)，增加羅非魚抗無乳鏈球菌免疫保護(hù)力。對篩選的B配方的復(fù)方中草藥免疫增強(qiáng)劑按1.5%添加于羅非魚飼料中采用分段法和不間斷投喂法投喂羅非魚，分析測定羅非魚增重率、肌肉成分、血清生化指標(biāo)、血清免疫指標(biāo)和腸道菌群的變化，發(fā)現(xiàn)在羅非魚養(yǎng)殖中采用分段法投喂中草藥免疫增強(qiáng)劑是一種實(shí)用的措施；將0.5%、1.0%、1.5%和2.0%含量的復(fù)方中草藥免疫增強(qiáng)劑添加至基礎(chǔ)料中分別投喂羅非魚，測定羅非魚血清中SOD活力、POD活力、PO活力、LZM活性、血清抗菌活力、MDA含量、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力、谷草轉(zhuǎn)氨酶活力、甘油三酯含量、總膽固醇含量的變化。羅非魚頭腎、脾臟、肝臟、腮、胸腺中IL-1β和TNF-α表達(dá)模式變化，羅非魚腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化，羅非魚肝體比變化，羅非魚肝臟脂肪含量和肌肉脂肪含量變化，羅非魚免疫保護(hù)力的變化和羅非魚肝臟組織病理學(xué)變化。發(fā)現(xiàn)不同含量的中草藥免疫增強(qiáng)劑飼料投喂羅非魚后均能顯著提高羅非魚免疫力、促進(jìn)腸道菌群微生態(tài)平衡、降低肝臟脂肪含量和肌肉脂肪含量、保護(hù)羅非魚肝臟和提高羅非魚對無乳鏈球菌的抵抗能力，其中以1.0%中草藥免疫增強(qiáng)劑對羅非魚肝臟組織保護(hù)、抵抗無乳鏈球菌的感染效果最好，最終篩選出中草藥添加劑按1.0%添加于羅非魚飼料為最佳中草藥免疫增強(qiáng)劑添加量。為探究本實(shí)驗室研發(fā)的用于改善羅非魚肌肉品質(zhì)和增強(qiáng)對鏈球菌病抵抗力的中草藥免疫增強(qiáng)劑在羅非魚養(yǎng)殖中使用的安全性，我們設(shè)計中草藥免疫增強(qiáng)劑對小鼠的急性毒性、亞急性毒性和養(yǎng)殖羅非魚亞急性毒性試驗，發(fā)現(xiàn)中草藥免疫增強(qiáng)劑在飼料中的添加劑量在3%以下時在羅非魚的養(yǎng)殖中使用是安全的，為該中草藥免疫增強(qiáng)劑在羅非魚養(yǎng)殖實(shí)踐應(yīng)用中提供理論依據(jù)。中草藥免疫增強(qiáng)劑的使用能有效控制羅非魚鏈球菌病，從而減少化學(xué)藥物的使用，降低養(yǎng)殖風(fēng)險，提高水產(chǎn)品的質(zhì)量，使水產(chǎn)品養(yǎng)殖和出口的規(guī)模進(jìn)一步擴(kuò)大，產(chǎn)生良好的社會效益及生態(tài)效益。三、增產(chǎn)增效情況2013年-2017年，本課題組研制的中草藥免疫增強(qiáng)劑在高州市石鼓鎮(zhèn)、鎮(zhèn)江鎮(zhèn)等地的羅非魚養(yǎng)殖廠、高州市龍灣水庫和四方田水庫、雷州市溪南水庫等地開展羅非魚養(yǎng)殖中的應(yīng)用示范，5年來建設(shè)應(yīng)用示范點(diǎn)和示范對照點(diǎn)各5個，示范面積累計共達(dá)到18400畝，其中應(yīng)用示范面積13200畝，示范對照面積5200畝，取得經(jīng)濟(jì)效益總計17039.22萬元。更重要的是2013年和2017年因示范區(qū)暴發(fā)羅非魚鏈球菌病，示范對照點(diǎn)的未投喂中草藥免疫增強(qiáng)劑的羅非魚因需防控該病而使用了化學(xué)藥物來調(diào)水和治病，給周邊的生態(tài)環(huán)境帶來了一定的隱患，而中草藥免疫增強(qiáng)劑的使用不僅在有效控制羅非魚鏈球菌病這個養(yǎng)殖瓶頸上發(fā)揮重要的作用，而且中草藥免疫增強(qiáng)劑的使用能顯著減少化學(xué)藥物的使用，提高養(yǎng)殖的成活率，降低養(yǎng)殖風(fēng)險，提高水產(chǎn)品的質(zhì)量，使水產(chǎn)品養(yǎng)殖和出口的規(guī)模進(jìn)一步擴(kuò)大，具有廣闊的市場前景，因此中草藥免疫增強(qiáng)劑的推廣應(yīng)用將推動羅非魚養(yǎng)殖業(yè)及相關(guān)產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，產(chǎn)生良好的社會效益及生態(tài)效益。四、技術(shù)要點(diǎn)確定了引起我國南方羅非魚鏈球菌病的病原為無乳鏈球菌，系統(tǒng)闡述無乳鏈球菌的生物學(xué)特性和羅非魚體液免疫與細(xì)胞免疫在鏈球菌感染中的作用，并結(jié)合上述研究，研制了針對羅非魚鏈球菌病的中草藥免疫增強(qiáng)劑并應(yīng)用示范，達(dá)到了國際領(lǐng)先水平，具體技術(shù)要點(diǎn)如下：1.系統(tǒng)闡述了無乳鏈球菌的生物學(xué)特性和致病機(jī)制：研究了無乳鏈球菌致病性、耐藥性、基因分型、基因組等生物學(xué)特性，并從分子生物學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)與轉(zhuǎn)錄組學(xué)多個角度研究了重要毒力因子功能，從而深入闡述無乳鏈球菌的致病機(jī)制。2．系統(tǒng)闡明了無乳鏈球菌感染羅非魚過程中的宿主免疫反應(yīng)分子機(jī)理：研究了羅非魚免疫因子在鏈球菌感染中的作用，并對部分因子的作用機(jī)理以及不同因子間的互作模式進(jìn)行了解析，闡明了羅非魚免疫相關(guān)分子抗病機(jī)理。3．研制了中草藥免疫增強(qiáng)劑用于羅非魚鏈球菌病的防治：在國內(nèi)首先成功研制了針對羅非魚鏈球菌病的中草藥免疫增強(qiáng)劑，采用分段投喂的方式可提升羅非魚的免疫力、促進(jìn)腸道菌群微生態(tài)平衡、降低肝臟脂肪含量和肌肉脂肪含量、保護(hù)羅非魚肝臟和提高羅非魚的抗病力，經(jīng)濟(jì)效益顯著。五、推廣情況2013年-2017年，本技術(shù)中的中草藥免疫增強(qiáng)劑在高州市石鼓鎮(zhèn)、鎮(zhèn)江鎮(zhèn)等地的羅非魚養(yǎng)殖廠、高州市龍灣水庫和四方田水庫、雷州市溪南水庫等地開展羅非魚養(yǎng)殖中的應(yīng)用示范。5年來建設(shè)應(yīng)用示范點(diǎn)和示范對照點(diǎn)各5個，示范面積累計共達(dá)到18400畝，其中應(yīng)用示范面積13200畝，示范對照面積5200畝。中草藥免疫增強(qiáng)劑在羅非魚養(yǎng)殖中的應(yīng)用示范結(jié)果表明，在所有應(yīng)用示范點(diǎn)中，羅非魚成活率均超過95%，而示范對照點(diǎn)羅非魚成活率最高僅為92.08%；所有應(yīng)用示范點(diǎn)體重超過500g的魚占比超過91.8%，而示范對照最高僅為86.27%。在2013年和2017年，應(yīng)用示范區(qū)暴發(fā)了由無乳鏈球菌引起的鏈球菌病，示范對照點(diǎn)在使用化學(xué)藥物的情況下均有超過10%的魚死亡，而應(yīng)用示范點(diǎn)在沒有使用化學(xué)藥物情況下養(yǎng)殖成活率卻均高達(dá)95%以上，這表明中草藥免疫增強(qiáng)劑在羅非