蘋果及蘋果制品中根皮苷的檢測方法 高效液相色譜法-編制說明

《蘋果中根皮苷的檢測方法-

高效液相色譜法》國家標準編制說明

1任務(wù)來源

本國家標準的制定任務(wù)是根據(jù)國家標準化管理委員會下達的國

家標準制定計劃《蘋果中根皮苷檢測方法-高效液相色譜法》項目（計

劃號為20205076-T-424）。由北京化工大學(xué)上報，中國標準化研究院

歸口及執(zhí)行，主管部門為國家市場監(jiān)督管理總局。本標準由北京化工

大學(xué)，中國標準化研究院，中華全國供銷合作總社濟南果品研究院，

中國農(nóng)業(yè)大學(xué)、蓬萊昊林果蔬有限公司、河北冠卓檢測科技股份有限

公司等單位起草。本標準主要起草人：魏蕓、路艷珍、席興軍、蘭韜、

鄭曉冬、倪漢文、周文峰、魯潤華、劉媛媛、劉聰、仵云仲、于瀟、

王文娟。

2起草的目的和意義

蘋果系薔薇科，蘋果亞科蘋果屬植物，原產(chǎn)于中亞、歐洲東南部

和我國的新疆西部[1]，是一種很重要的經(jīng)濟作物。蘋果的生態(tài)適應(yīng)性

強，果實的營養(yǎng)價值高、耐貯性好、供應(yīng)周期長，是世界最重要的，

也是我國農(nóng)業(yè)部確定的一種優(yōu)勢農(nóng)產(chǎn)品[2]。新鮮的蘋果中含有約85%

的水分和14%的碳水化合物（主要是纖維和果糖），吃起來酸甜可口，

此外蘋果中還含有維生素（0.02-0.3%）、礦物質(zhì)（0.1-0.3%）、有機

酸（0.02-0.1%）和多酚（0.1-0.6%）等[3-6]，營養(yǎng)價值較高，且易于人

體吸收，具有較好的保健作用，被廣泛用作膳食補充劑。

流行病學(xué)研究表明，通過食用蘋果及相關(guān)產(chǎn)品可以降低一些疾病

的發(fā)病率。如Boyer等[7]研究發(fā)現(xiàn)蘋果還可以降低II型糖尿病風險，

Marchand等[8]發(fā)現(xiàn)日常食用大量的蘋果、洋蔥以及葡萄柚可以降低

3

40-50%的肺癌風險，Michels等[9]發(fā)現(xiàn)食用大量的蘋果可以降低腺瘤

風險，Jedrychowski等[10]發(fā)現(xiàn)每天吃一個以上的蘋果可以降低約50%

的大腸癌風險，Chai和Sesso等[11,12]發(fā)現(xiàn)食用蘋果及蘋果脆可降低

13-22%的心血管疾病風險。蘋果的這些功效與其組分的含量及抗氧

化活性相關(guān)，Boyer等[7]報道蘋果中的抗氧化活性成分的含量僅次于

蔓越莓，位列水果中第二位，D'Angelo等[13]也發(fā)現(xiàn)100g蘋果表現(xiàn)出

的抗氧化活性相當于1.5mg維生素C（VC）的抗氧化活性，但是蘋

果中含有的VC的量對總抗氧化活性的貢獻值還不到0.4%，大部分

的抗氧化活性主要由其組成中的的多酚體現(xiàn)，一般來說，多酚含量越

高，抗氧化活性越強。因此，近年來，科研工作者投入了大量的時間

和金錢在研究蘋果的多酚組成及含量上。研究結(jié)果表明，蘋果中的多

酚組成主要有槲皮素類和根皮苷。

蘋果中根皮苷的分離純化及檢測工藝目前沒有相關(guān)國家標準，沒

有一定規(guī)模的應(yīng)用，而且產(chǎn)業(yè)化目前還沒形成。因此非常有必要制定

相關(guān)標準。

21企業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量控制的需要

.我國的蘋果主要種植在西北黃土高原和渤海灣兩大區(qū)域，約占總

栽培面積的80%，其中陜西、山東、河南、山西、河北、甘肅、遼寧、

新疆等地是主要產(chǎn)區(qū)，年產(chǎn)量均在百萬噸以上，占蘋果生產(chǎn)總量的

90%。蘋果種植面積大、產(chǎn)量高，味道甜美，是我國最受歡迎的水果

之一。同時，以蘋果為原料生產(chǎn)蘋果提取物，從而實現(xiàn)農(nóng)副產(chǎn)品再利

用，這越來越受到重視。但是根皮苷含量測定尚無國家標準,且根皮

4

苷原料的提取工藝不同,導(dǎo)致原料質(zhì)量標準不統(tǒng)一,藥品臨床療效不

穩(wěn)定。因此，本標準的制定是企業(yè)進行產(chǎn)品質(zhì)量控制的需要。

22完善國家標準的需要

.是進一步完善和健全蘋果產(chǎn)品質(zhì)量標準的迫切需要。根皮苷含量

作為是公認的蘋果質(zhì)量評價的關(guān)鍵性質(zhì)量指標，作為一項蘋果的品質(zhì)

評價指標具有重要的意義。但是目前針對蘋果質(zhì)量標準當中，由于缺

乏蘋果中根皮苷的檢測方法，在目前已經(jīng)發(fā)布實施的國家標準GB/T

10651-2008《鮮蘋果》沒有設(shè)置根皮苷含量這一重要的質(zhì)量評價指

標，而是設(shè)置了最簡單的可溶性固形物含量等這一較為常見的質(zhì)量指

標，不利于蘋果行業(yè)的進一步健康發(fā)展。因此，這項通用基礎(chǔ)性的檢

測方法標準的制定，將為今后所有蘋果相關(guān)標準的制定奠定良好的基

礎(chǔ)。

3根皮苷研究/應(yīng)用與標準現(xiàn)狀

31根皮苷研究

.國內(nèi)外對根皮苷的研究十分廣泛，可查詢到大量的論文與專利，

研究范圍包括提取分離、純品制備、分析檢測、結(jié)構(gòu)表征、藥理活性、

毒性、分子結(jié)構(gòu)改性、產(chǎn)品加工等方面。

32根皮苷開發(fā)應(yīng)用

.根皮苷是從蘋果、蘋果樹皮及葉等中提取而得，它是蘋果樹體內(nèi)

的酚類物質(zhì)。國內(nèi)外的臨床研究表明，根皮苷在治療糖尿病方面有很

好的療效。根皮苷能激活蜂窩蛋白激酶，對細胞無序增生有抑制作用，

可用于皮膚癌及其他腫瘤的輔助治療。還具有降低血糖、改善記憶力、

5

抗氧化、抗炎、抗過敏等多種重要的生物活性，同時還可以抑制黑色

素的形成,減淡茶褐色、灰色班和雀斑的色澤，在食品、美容和保健

品行業(yè)都有潛在的利用價值。

目前根皮苷已經(jīng)批準成為食品添加劑，其糖基水解能夠形成葡萄

糖，加之含量高，所以被許多學(xué)者認為是碳水化合物的一種貯藏形式，

是一種甜度非常高的天然非糖甜味劑，可以作為甜食愛好者的糖尿病

人的糖類替代食品。它被多酚氧化酶氧化后生成的產(chǎn)物可以轉(zhuǎn)化生成

亮黃色的染料，這種染料的水溶性強，可用于食品加工業(yè)，替代人工

染料，避免人工合成色素帶來的毒害作用。由于這些良好的性能，其

在新型藥物和功能性食品的開發(fā)中具有廣闊的前景。

33根皮苷標準

.已有大量文獻及支撐材料證明，蘋果及其皮和渣中含量較高的根

皮苷，作為一種天然抗氧化劑，在食品化工、醫(yī)療保健、化妝品等領(lǐng)

域發(fā)揮著重要的作用。根皮苷作為食品添加劑，抗氧化性效用廣泛并

且作用溫和、無毒、綠色、健康的特點；根皮苷作為化妝品原料，抗

氧化功能很強，具有顯著美白、抗皺、保濕等作用，能清除皮膚內(nèi)的

自由基，對油脂的抗氧化濃度在(10~30)×10-6之間，能阻止糖類成分

進入表皮細胞，從而抑制皮腺的過度分泌，治療分泌旺盛型粉刺；能

抑制黑素細胞活性，對各種皮膚色斑有淡化作用等。同時能吸收本身

重量4~5倍的水，能促進配方中其它功能因子的吸收利用，使其發(fā)揮

出更好的功效。因此從蘋果皮渣提取出來的根皮苷，可應(yīng)用于面膜、

護膚膏霜、乳液和精華素中。而目前我國目前根皮苷的檢測方法標準

6

為空白，導(dǎo)致根皮苷原料質(zhì)量難以檢測和控制，生產(chǎn)企業(yè)又缺乏技術(shù)

力量研發(fā)檢測方法，一定程度導(dǎo)致了市場上該原料的質(zhì)量參差不齊，

市場混亂。

截止2020年7月24日，國家藥品監(jiān)督管理局顯示的持有化妝

品生產(chǎn)許可證的企業(yè)有5292家，而我國化妝品注冊備案的企業(yè)約７

萬多家，大約有九成以上的企業(yè)委托生產(chǎn)，市面上60％以上的產(chǎn)品

聲稱具有美白、抗皺、保濕的產(chǎn)品。因此，這類化妝品當中的根皮苷

含量測定，將極大滿足這些生產(chǎn)企業(yè)質(zhì)量控制和產(chǎn)品研發(fā)的需要。同

時，也將為所有相關(guān)的檢測機構(gòu)如國家化妝品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心（廣

州））、國家化妝品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心（北京））、國家食品質(zhì)量監(jiān)

督檢驗中心、國家食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心（廣東）、中國檢科院綜合

檢測中心、山東食品藥品檢驗研究院、國家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中

心(濟南)、北京市食品安全監(jiān)控和風險評估中心、普寧華測、北京京

畿檢測技術(shù)有限公司、中國農(nóng)科院質(zhì)標所、浙江省農(nóng)科院質(zhì)量標準研

究所、山東農(nóng)科院質(zhì)標所等市場監(jiān)管系統(tǒng)檢測機構(gòu)、農(nóng)業(yè)系統(tǒng)檢測機

構(gòu)和第三方檢測，在相關(guān)產(chǎn)品的檢測抽查、質(zhì)量監(jiān)督和風險評估方面，

提供一個權(quán)威急需的通用基礎(chǔ)性檢測方法標準。

4.編制過程

41成立標準制定工作組

.2019年11月10日在北京化工大學(xué)召開了國家標準《蘋果中根皮苷

檢測方法-高效液相色譜法》第一次起草工作會議，成立了標準起草

工作組，并進行了任務(wù)分工。起草工作組成員包括北京化工大學(xué)，中

7

國標準化研究院，中華全國供銷合作總社濟南果品研究院，中國農(nóng)業(yè)

大學(xué)等，相關(guān)的企業(yè)和行業(yè)蓬萊昊林果蔬有限公司、河北冠卓檢測科

技股份有限公司等單位參加了研討會。按照工作任務(wù)要求，工作組進

行了任務(wù)分解，制定了標準起草工作計劃和任務(wù)分工表。

42確定工作計劃和標準制定原則

.為保證標準的先進性和適用性，標準起草工作組在充分討論和研

究的基礎(chǔ)上，明確了指標選擇與確定的以下原則：

（1）遵循國家有關(guān)方針、政策和法規(guī)，結(jié)合實驗數(shù)據(jù)確定技術(shù)指標。

（2）技術(shù)水平與生產(chǎn)實際相結(jié)合；密切結(jié)合我國國情，嚴格執(zhí)行強

制性國家標準，參考行業(yè)標準，同時也考慮到與其它相關(guān)標準相協(xié)調(diào)。

（3）優(yōu)先體現(xiàn)質(zhì)量引導(dǎo)和規(guī)范作用，兼顧可操作性。

43查閱國內(nèi)外相關(guān)標準和文獻資料

.標準起草工作組首先收集、翻譯和整理了國內(nèi)外有關(guān)研究進展和

先進國家的相關(guān)標準、法規(guī)等文獻資料，掌握了有關(guān)標準現(xiàn)狀；并對

我國現(xiàn)有蘋果相關(guān)標準中的術(shù)語、指標等技術(shù)內(nèi)容進行了歸納和總

結(jié)，為標準文本的編制奠定理論基礎(chǔ)。

積極籌備標準制定前期工作。為了使本標準更具有先進性、科學(xué)

性，廣泛聽取了行業(yè)內(nèi)多家企業(yè)的意見；同時聯(lián)合行業(yè)重點企業(yè)，從

廣西、北京、山東、遼寧等地區(qū)收集樣品，收集國內(nèi)蘋果重點生產(chǎn)企

業(yè)樣品。

經(jīng)查閱大量學(xué)術(shù)文獻，制定了科學(xué)嚴謹?shù)馁|(zhì)量指標檢測、評價實

驗方案和任務(wù)分工，確定根皮苷含量作為質(zhì)量指標進行檢測，建立高

8

效液相色譜檢測蘋果中根皮苷。

44研究建立標準方法，開展條件實驗

.標準工作組按照計劃任務(wù)書的要求，結(jié)合制定標準的要求，研究

建立標準方法的實驗方案，并進行方法前處理條件的選擇、儀器條件

的確定和方法精密度、準確度及檢出限的測定等試驗。

2019年11月始，標準起草工作組赴陜西省、山東省等蘋果主產(chǎn)

地進行調(diào)研，獲取了大量相關(guān)信息與數(shù)據(jù)，采集了多份樣品。

第一批樣品采集后，開始開展實驗室研究及驗證工作，建立根皮

苷高效液相色譜分析方法，包括線性范圍、相關(guān)系數(shù)、加標回收率、

準確度、精密度、檢出限、定量限等；蘋果中根皮苷的粗提。

45方法驗證

.2021年1月2日～2021年2月26日，由5家單位對“蘋果中根

皮苷的高效液相色譜檢測方法”進行驗證，分別是中國標準化研究院，

中華全國供銷合作總社濟南果品研究院，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)、山東悟空儀

器有限公司、北京市理化分析測試中心，通過統(tǒng)計檢驗確認外部實驗

室試驗結(jié)果的準確性。

46形成標準草案

.標準起草工作組查閱、收集和整理了國內(nèi)外有關(guān)研究進展和專

利、標準、法規(guī)等文獻資料，掌握了相關(guān)標準的現(xiàn)狀；對文獻中根皮

苷測定方法進行了對比和總結(jié)，為標準文本的編制奠定理論基礎(chǔ)。在

《蘋果中根皮苷的高效液相色譜檢測方法》國家標準第一次起草工作

會議的基礎(chǔ)上，起草小組按照GB1.1-2009《標準化工作導(dǎo)則第1部

9

分：標準的結(jié)構(gòu)和編寫》的編寫規(guī)定，共同討論起草形成了《蘋果中

根皮苷的高效液相色譜檢測方法》國家標準的技術(shù)框架和主要內(nèi)容，

初步形成了《蘋果中根皮苷的高效液相色譜檢測方法》標準草案。

47形成標準討論稿和編制說明

.2020年2月底在北京召開了《蘋果中根皮苷檢測方法-高效液相

色譜法》國家標準第二次起草視頻工作會，在本次工作會上起草工作

組及相關(guān)單位共同討論了標準的技術(shù)框架和主要內(nèi)容。

與會專家對《蘋果中根皮苷檢測方法-高效液相色譜法》標準草

案中的英文名稱、范圍、術(shù)語和定義、基本要求、主要技術(shù)指標、附

錄等章條提出了詳細的意見，會后根據(jù)修改意見形成了《蘋果中根皮

苷檢測方法-高效液相色譜法》標準討論稿及其編制說明。

48形成標準征求意見稿和編制說明

.2020年5月12日，起草工作組組織相關(guān)單位和專家召開了第三

次標準起草工作視頻會議。參加單位包括北京化工大學(xué)、中華全國供

銷合作總社濟南果品研究院、中國標準化研究院、中國農(nóng)業(yè)大學(xué)、中

科院蘭化所青島分所等單位。與會專家及起草組成員對《蘋果中根皮

苷檢測方法-高效液相色譜法》國家標準草案中的英文名稱、范圍、

術(shù)語和定義、技術(shù)指標等條款內(nèi)容提出了詳細的意見，會后根據(jù)修改

意見形成了《蘋果中根皮苷檢測方法-高效液相色譜法》國家標準征

求意見稿及其編制說明。

49征求意見并形成標準送審稿和編制說明

.2021年3月1日-2021年5月1日，起草工作組根據(jù)討論的專家

10

和單位名單，分別作為主持單位向相關(guān)的行業(yè)主管部門、科研機構(gòu)、

檢測部門和企業(yè)等30個單位和專家發(fā)出了標準征求意見稿，向相關(guān)

單位和專家公開征求標準修改意見。截止到2021年7月1日，共收

集到XXX等研究機構(gòu)、檢測機構(gòu)、生產(chǎn)企業(yè)、銷售企業(yè)等單位提出

的反饋意見XX條。起草工作組對提出的意見經(jīng)過反復(fù)研究、討論和

處理后，修改形成了送審稿及編制說明。具體意見匯總和處理表見標

準征求意見匯總處理表。

5本標準與國內(nèi)外分析方法的關(guān)系

本標準研究旨在建立一項滿足我國常用水果蘋果中根皮苷含量

檢測要求，在質(zhì)量控制目標和技術(shù)手段上與國際接軌，適應(yīng)我國大部

分農(nóng)副產(chǎn)品質(zhì)控實驗室儀器設(shè)備和技術(shù)能力的檢測方法標準。通過查

閱國內(nèi)外相關(guān)文獻資料，制定條件優(yōu)化方案，確保本方法前處理所采

用的裝置操作簡便，能夠滿足國內(nèi)實驗室的條件要求。本標準采用高

效液相色譜法（HPLC）測定根皮苷。樣品的前處理，即蘋果中根皮

苷的提取，檢測方法參考文獻資料，選擇合適的色譜柱以及儀器條件。

力求方法在穩(wěn)定、可靠和實用的基礎(chǔ)上，達到國際先進水平，以適應(yīng)

我國農(nóng)副產(chǎn)品蘋果中根皮苷含量檢測、質(zhì)控與管理的需要。

6主要技術(shù)指標依據(jù)與說明

61標準名稱

.該標準名稱按照國家標準立項計劃確定，為促進行業(yè)發(fā)展和其他

領(lǐng)域包括食品、保健品廣泛使用，主要解決蘋果中根皮苷測定的技術(shù)

問題，所以將本標準的名稱定為：《蘋果中根皮苷檢測方法-高效液

11

相色譜法》。翻譯為“DeterminationofphlorizininapplesHigh

performanceliquidchromatography”。

62前言

.明確了本標準的歸口單位及主要起草單位、起草人。

63主體內(nèi)容

.標準的主體內(nèi)容包括：范圍、規(guī)范性引用文件、原理、試劑、儀

器和設(shè)備、測定步驟、空白試驗、結(jié)果計算與表示、精密度和回收率、

檢出限、檢驗報告等。

64“范圍”的界定

.本標準規(guī)定了用高效液相色譜法測定蘋果中根皮苷含量的原理、

材料、儀器與設(shè)備、測定步驟、結(jié)果計算與表示、精密度和回收率、

檢驗報告。

本標準適用于蘋果中根皮苷定性和含量測定。

65原理

.樣品經(jīng)提取等前處理后，將提取液過濾，經(jīng)高效液相色譜分離測

定，根據(jù)保留時間定性，外標峰面積定量。

66試劑

6.6.1乙腈：色譜純。

6.6.2根皮苷（CAS：60-18-1）標準品：純度≥98.0%。

6.6.3有機濾模：孔徑0.45μm。

6.6.4流動相：A.乙腈：B.0.01%三氟乙酸水溶液=25:75，流速：

1.0mL/min。

12

6.6.5根皮苷標準儲備溶液（1.0mg/mL）：準確稱取根皮苷標準品

25mg（精確至0.0001g）于25mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至

刻度，配制成濃度為1.0mg/mL的標準儲備液。放置于4℃冰箱避光

保存，有效期為一個月。

6.6.6根皮苷標準中間液（500μg/mL）：準確吸取12.5mL根皮苷標

準儲備液（6.6.5）于25mL容量瓶中，用乙腈定容。放置于4℃冰箱

避光保存，有效期為一個月。

6.6.7根皮苷系列標準工作液：分別吸取根皮苷標準中間液（6.6.6）

0.1mL、0.2mL、0.5mL、1.0mL、2.0mL、5.0mL、10mL至10mL

容量瓶中，用乙腈定容。該標準系列濃度分別為5.0μg/mL、10.0

μg/mL、25.0μg/mL、50.0μg/mL、100.0μg/mL、250.0μg/mL、500

μg/mL、1000μg/mL。臨用時配制。

6.6.8除另外有規(guī)定外，所用試劑均為分析純，水應(yīng)復(fù)合GB/T6682

中一級水的要求

67儀器和設(shè)備

6.7.1高效液相色譜儀，配有紫外檢測器或二極管陣列檢測器。

6.7.2天平：感量為0.0001g和0.001g。

6.7.3油浴鍋。

6.7.4超聲波清洗器。

6.7.50.45μm微孔水相濾膜，0.45μm針筒式有機相過濾器。

6.7.6旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

13

68蘋果樣品制備

.將蘋果用干凈紗布輕輕將樣品表面擦凈，將其切碎，混合均勻，

保存待用。

69蘋果粗品提取

.將蘋果樣品，用干凈紗布輕輕將樣品表面擦凈，將其切碎，混合

均勻，稱取20.00g樣品（精確到0.001g）加入90%乙醇水溶液100mL，

6000r/min，勻漿3min，再加入300mL90%乙醇水溶液轉(zhuǎn)移至1L圓

底燒瓶中，放入梭形轉(zhuǎn)子，輕輕搖晃使樣品和溶劑混合均勻，調(diào)節(jié)磁

力攪拌器使轉(zhuǎn)子能夠帶動溶液攪拌，80℃加熱回流1h后（保證回流

速度達到1滴/s，如果未到達，適當提高1~2℃），冷卻過濾，45℃

旋蒸，旋蒸至60mL，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加80mL乙酸乙酯萃取兩

次，（如有乳化現(xiàn)象，通過4000r/min，離心2min進行破乳）合并

兩次的乙酸乙酯相于250mL圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，每次采用

1.0mL色譜甲醇清洗圓底燒瓶3次，全部轉(zhuǎn)移至5mL容量瓶中，加

色譜甲醇定容至刻度，過0.45μm針筒式有機相過濾器，即為試樣液。

610根皮苷HPLC定量分析方法的建立

6.10.1檢測波長選擇

圖1根皮苷標準樣品的3D譜圖

分析條件：液相色譜柱，ProdigyTMODS-3C18(250×4.6mmID,

5μm)；流動相，甲醇:水=51:49(v/v)；流速，1.0mL?min-1；柱溫，30℃；

14

進樣體積，10μL；運行時間，15min；檢測波長，190-400nm。除溶

劑峰外，其他波長下無雜峰出現(xiàn)。由于大多數(shù)雜質(zhì)在254nm下有紫

外響應(yīng)，因此選用254nm作為檢測波長。

6.10.2色譜柱的選擇

采用兩根不同的C18色譜柱，測定根皮苷標準樣品的純度。

6.10.2.1Apollo-C18(150×4.6mm,5μm)柱

分析條件：流動相，甲醇:水=40:60(v/v)；流速，1.0mL?min-1；

柱溫，30℃；進樣體積，10μL；運行時間，15min；檢測波長，254

nm。

100

80

60

m40

A

u

20

0

02468101214

Time(min)

15

8

4

0

m

A

u-4

-8

02468101214

Time(min)

圖2Apollo-C18色譜柱根皮苷標準樣品及空白HPLC圖譜

扣除溶劑色譜峰后，對樣品色譜峰進行面積歸一化法定量，經(jīng)積

分，根皮苷純度為99.86%。

6.10.2.2Interial-ODSC18(250×4.6mmID,5μm)柱

分析條件：流動相，甲醇:水=50:50(v/v)；流速，1.0mL?min-1；

柱溫，30℃；進樣體積，10μL；運行時間，16min；檢測波長，254

nm。

120

100

80

60

m

A

u40

20

0

0246810121416

Time(min)

16

8

4

0

m

A

u

-4

-8

0246810121416

Time(min)

圖3Interial-ODSC18色譜柱根皮苷標準樣品及空白HPLC圖譜

扣除溶劑色譜峰后，對樣品色譜峰進行面積歸一化法定量，經(jīng)積

分，根皮苷純度為99.90%。

6.10.3不同洗脫條件

6.10.3.1等度洗脫

分析條件：液相色譜柱，ProdigyTMODS-3C18(250×4.6mm

ID,5μm)；流動相，甲醇:水=51:49(v/v)；流速，1.0mL?min-1；

柱溫，30oC；進樣體積，10μL；運行時間，15min；檢測波長，254

nm。

17

250

200

150

m

A100

u

50

0

02468101214

Time(min)

8

4

0

m

A

u

-4

-8

02468101214

Time(min)

18

8

4

0

m

A

u

-4

-8

02468101214

Time(min)

圖4根皮苷標準樣品及空白甲醇等度洗脫HPLC圖譜

扣除溶劑色譜峰后，對樣品色譜峰進行面積歸一化法定量，經(jīng)積

分，根皮苷純度為99.87%。

分析條件：液相色譜柱，ProdigyTMODS-3C18(250×4.6mm

ID,5μm)；流動相，乙腈:水=51:49(v/v)；流速，1.0mL?min-1；

柱溫，30℃；進樣體積，10μL；運行時間，15min；檢測波長，254

nm。

250

200

150

m

A100

u

50

0

02468101214

Time(min)

19

8

4

0

m

A

u-4

-8

02468101214

Time(min)

圖5根皮苷標準樣品及空白乙腈等度洗脫HPLC圖譜

扣除溶劑色譜峰后，對樣品色譜峰進行面積歸一法定量，經(jīng)積分，

根皮苷純度為99.85%。

分析條件：液相色譜柱，ProdigyTMODS-3C18(250×4.6mm

ID,5μm)；流動相，乙腈:0.01%三氟乙酸水溶液=25:75(v/v)；流

速，1.0mL?min-1；柱溫，30℃；進樣體積，10μL；運行時間，30

min；檢測波長，254nm。

圖6根皮苷標準樣品及空白乙腈等度洗脫HPLC圖譜

20

對樣品色譜峰進行面積歸一法定量，經(jīng)積分，根皮苷純度為

99.87%。

6.10.3.2梯度洗脫

液相色譜柱，ProdigyTMODS-3C18(250×4.6mmID,5μm)；

流動相，A為甲醇，B為水，0-30min10%A-100%A30-40min

100%A；流速，1.0mL?min-1；柱溫，30℃；進樣體積，10μL；運

行時間：40min；檢測波長：254nm。

500

400

300

m

A

u200

100

0

0510152025303540

Time(min)

50

40

30

20

m

A

u

10

0

-10

0510152025303540

Time(min)

圖7根皮苷標準樣品及空白梯度洗脫HPLC圖譜

21

扣除溶劑色譜峰后，對樣品色譜峰進行面積歸一化法定量，經(jīng)積

分，根皮苷純度為99.88%，未發(fā)現(xiàn)明顯的雜質(zhì)峰存在。

6.10.4根皮苷HPLC法檢測優(yōu)化后的色譜條件

根皮苷HPLC檢測優(yōu)化后的色譜條件為

色譜柱：C18液相色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）或具有同等性能的

色譜柱。

紫外檢測波長：254nm

流動相：乙腈：0.01%三氟乙酸水溶液=25:75。

流速：1.0mL/min。

進樣體積：10μL

柱溫：30℃。

6.10.5標準曲線

按照“6.6.7標準溶液配制”配制一系列濃度分別為5.0μg/mL、

10.0μg/mL、25.0μg/mL、50.0μg/mL、100.0μg/mL、250.0μg/mL、

500.0μg/mL、1000.0μg/mL的根皮苷標準溶液，按照“6.10.4根皮苷

HPLC法檢測優(yōu)化后的色譜條件”進行HPLC分析，以根皮苷標準溶

液濃度X（μg/mL）為橫坐標、色譜峰面積Y為縱坐標進行線性擬合，

擬合結(jié)果見表1.

表1.根皮苷的標準曲線、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

目標物標準曲線線性范圍相關(guān)系數(shù)檢出限定量限

(μg/mL)(r2)(ng/mL)(ng/mL)

根皮苷Y=27.59X-18.895.0-1000.00.99916.8522.83

22

6.10.6檢出限和定量限

6.10.6.1儀器檢出限和定量限

將對照品溶液逐步稀釋，進行液相色譜分析，計算其峰高與基線

噪音高的比，S/N=3（S為對照品峰高，N為基線噪音高）時的對照品

濃度為檢出限（LOD），得到根皮苷的檢出限ng/mL；S/N=10時的濃

度為定量限（LOQ），得到根皮苷的定量限為ng/mL。根皮苷的檢出

限（LOD）和定量限（LOQ）是根據(jù)國際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會

（IUPAC）對LOD和LOQ的定義，經(jīng)計算得到。計算公式為：

LOD=3×SB/b，LOQ=10×SB/b式中，SB為10次空白試驗得到的噪音信

號平均值，b為根皮苷標準曲線的斜率。由表1可知，該方法的檢出限

為6.85ng/mL、定量限為22.83ng/mL。

6.10.6.2方法檢出限和定量限

將實際樣品溶液逐步稀釋，進行液相色譜分析，計算其峰高與基

線噪音高度的比，S/N=3（S為樣品溶液峰高，N為基線噪音高）時的

樣品溶液濃度為檢出限（LOD），得到蘋果試樣取樣量為20g時，檢

出限為0.83μg/mL，定量限為2.78μg/mL。

6.10.7精密度

取蘋果實際樣品溶液，按照“6.10.4根皮苷HPLC法參考色譜條

件”進行HPLC分析，重復(fù)進樣6次，測得其保留時間和峰面積，計算

其相對標準偏差（RSD），結(jié)果見表2。由結(jié)果表2可知，該方法的精

密度良好。

23

表2.根皮苷的精密度試驗結(jié)果（n=6）

序號保留時間峰面積

TimeRSD(%)AreaRSD(%)

113.7131436

213.7601432

313.7710.35514390.222

413.7171435

513.7071433

613.6961430

6.10.8標準溶液穩(wěn)定性

取100μg/mL的根皮苷標準樣品溶液，分別在0、2、4、6、8、10

h時，按照“6.10.4根皮苷HPLC法參考色譜條件”進行HPLC分析，測

得其保留時間和峰面積，計算其相對標準偏差（RSD），結(jié)果見表3。

由結(jié)果表3可知，該方法的穩(wěn)定性良好。

表3.根皮苷的穩(wěn)定性試驗結(jié)果（n=6）

檢測時間保留時間峰面積

（h）TimeRSD(%)AreaRSD(%)

013.7132872

213.7922875

413.7600.27728380.773

613.6962882

813.7712826

1013.7172882

6.10.9重復(fù)性

準確稱取20g（精確至0.001g）蘋果樣品6份，按照6.9處理樣

品進行根皮苷提取，制備得到樣品溶液24份。按照“6.10.4根皮苷

HPLC法參考色譜條件”進行HPLC分析，測得其保留時間和峰面積，

計算其相對標準偏差（RSD），結(jié)果見表4。由結(jié)果表4可知，該方法

的重復(fù)性良好。

24

表4.根皮苷的重復(fù)性試驗結(jié)果（n=6）

序號保留時間峰面積

TimeRSD(%)AreaRSD(%)

113.8131436

213.7601432

313.7710.32714360.150

413.7171435

513.7071438

613.6961434

6.10.10穩(wěn)定性

取蘋果實際樣品溶液，分別在0、2、4、6、8、10h、24h時，按

照“6.10.4根皮苷HPLC法參考色譜條件”進行HPLC分析，測得其峰面

積，換算含量，計算其相對標準偏差（RSD），結(jié)果見表5。由結(jié)果

表5可知，該方法的穩(wěn)定性良好。

表5實際樣品試樣穩(wěn)定性實驗結(jié)果

檢測時間（h）蘋果樣品中根皮苷濃度（μg/mL）RSD(%)

047.50

247.48

447.51

647.480.027

847.49

1047.51

2447.50

6.10.11加標回收率試驗

精密取蘋果樣品0.5mL，按照“6.10.4根皮苷HPLC法參考色譜條

件”進行HPLC分析，根據(jù)根皮苷的標準曲線計算出蘋果樣品溶液中

根皮苷的濃度為2.375μg/mL，換算成蘋果中根皮苷的含量為0.475

mg/kg。另精密取該已知根皮苷含量的蘋果樣品9份，每3份分別精密

加入濃度為100μg/mL的根皮苷標準樣品0.1mL、0.2mL和0.3mL，按

25

照6.9處理樣品進行根皮苷提取，按照“6.10.4參考色譜條件”進行

HPLC分析，計算其回收率，結(jié)果見表6。

表6.根皮苷樣品的加標回收率試驗結(jié)果(蘋果)

序號樣品含量添加量實測值回收率平均回收率RSD

(μg)(μg)(μg)(%)(%)(%)

123.751039.84118.04112.124.64

236.54108.27

337.14110.04

42041.8495.6399.213.68

543.3499.06

645.03102.93

73046.5386.5788.141.92

847.2587.91

948.3489.93

611方法驗證

6.11.1參加驗證的實驗室

選擇5家具有資質(zhì)的實驗室參加方法的驗證工作（表10）。向

驗證單位提供方法草案、驗證方案、標準溶液和驗證報告格式。驗證

單位按照方法草案準備實驗用品，在規(guī)定時間內(nèi)完成驗證實驗并反饋

驗證結(jié)果報告。在方法驗證前，參加驗證的操作人員應(yīng)熟悉和掌握方

法原理、操作步驟及流程。方法驗證過程中所用的試劑和材料、儀器

和設(shè)備及分析步驟應(yīng)符合方法相關(guān)要求。

7采用國際標準和國外先進標準程度，以及與國際、國外同類標準水

平的對比情況

目前根皮苷含量測定方法無國際標準和國外先進標準可參照。本

標準在制訂過程中對以根皮苷為活性成分的蘋果的質(zhì)量、檢測和市場

進行了充分的調(diào)查研究，并廣泛征求和采納了國內(nèi)相關(guān)領(lǐng)域?qū)＜业囊?/p>

見和建議，所制定的標準適合我國國情，具有先進性、科學(xué)性、實用

26

性和可操作性。

8與現(xiàn)行法律法規(guī)和強制性標準的關(guān)系

標準所確定的各項技術(shù)指標和內(nèi)容符合我國現(xiàn)行的有關(guān)方針、政

策，并與相關(guān)法律、法規(guī)、標準吻合。

本標準頒布實施后，填補我國蘋果中根皮苷檢測方法的空白，更

有利于行業(yè)應(yīng)用；與現(xiàn)行的法律、法規(guī)及其他國家標準沒有矛盾。

9標準作為強制性或推薦性標準的意見

建議本標準作為推薦性國家標準發(fā)布。

10實施標準的建議

如果本標準被批準并發(fā)布，為了貫徹好本標準，使其有效發(fā)揮作

用，建議在標準發(fā)布后，在相關(guān)企業(yè)和檢測機構(gòu)進行宣傳和貫徹，并

組織有關(guān)部門和人員進行學(xué)習(xí)和培訓(xùn)。

11參考文獻

27

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29

附錄A

圖A.1根皮苷標準溶液的色譜圖。

圖A.2蘋果90%乙醇粗提物的色譜圖。

30

目錄

1任務(wù)來源..........................................................................................................................................3

2起草的目的和意義.........................................................................................................................3

2.1企業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量控制的需要.................................................................................................4

2.2完善國家標準的需要..........................................................................................................5

3根皮苷研究/應(yīng)用與標準現(xiàn)狀.......................................................................................................5

3.1根皮苷研究..........................................................................................................................5

3.2根皮苷開發(fā)應(yīng)用..................................................................................................................5

3.3根皮苷標準..........................................................................................................................6

4.編制過程..........................................................................................................................................7

4.1成立標準制定工作組..........................................................................................................7

4.2確定工作計劃和標準制定原則.........................................................................................8

4.3查閱國內(nèi)外相關(guān)標準和文獻資料.....................................................................................8

4.4研究建立標準方法，開展條件實驗.................................................................................9

4.5方法驗證..............................................................................................................................9

4.6形成標準草案......................................................................................................................9

4.7形成標準討論稿和編制說明...........................................................................................10

4.8形成標準征求意見稿和編制說明...................................................................................10

4.9征求意見并形成標準送審稿和編制說明.......................................................................10

5本標準與國內(nèi)外分析方法的關(guān)系..............................................................................................11

6主要技術(shù)指標依據(jù)與說明..........................................................................................................11

6.1標準名稱............................................................................................................................11

6.2前言....................................................................................................................................12

6.3主體內(nèi)容............................................................................................................................12

6.4“范圍”的界定......................................................................................................................12

6.5原理....................................................................................................................................12

6.6試劑....................................................................................................................................12

6.7儀器和設(shè)備........................................................................................................................13

6.8蘋果樣品制備....................................................................................................................14

6.9蘋果粗品提取....................................................................................................................14

6.10根皮苷HPLC定量分析方法的建立.............................................................................14

6.10.1檢測波長選擇......................................................................................................14

6.10.2色譜柱的選擇......................................................................................................15

6.10.3不同洗脫條件......................................................................................................17

6.10.4根皮苷HPLC法檢測優(yōu)化后的色譜條件..........................................................22

6.10.5標準曲線...............................................................................................................22

6.10.6檢出限和定量限..................................................................................................23

6.10.7精密度...................................................................................................................23

6.10.8標準溶液穩(wěn)定性..................................................................................................24

6.10.9重復(fù)性...................................................................................................................24

6.10.10穩(wěn)定性.................................................................................................................25

6.10.11加標回收率試驗.................................................................................................25

6.11方法驗證..........................................................................................................................26

6.11.1參加驗證的實驗室...............................................................................................26

1

6.11.2方法驗證結(jié)果......................................................................錯誤！未定義書簽。

6.12實際樣品檢測.................................................................................錯誤！未定義書簽。

6.13驗證結(jié)論.........................................................................................錯誤！未定義書簽。

7采用國際標準和國外先進標準程度，以及與國際、國外同類標準水平的對比情況..........26

8與現(xiàn)行法律法規(guī)和強制性標準的關(guān)系......................................................................................27

9標準作為強制性或推薦性標準的意見......................................................................................27

10實施標準的建議..........................................................................................