食用菌病害檢疫鑒定方法

ICS65.020.01

CCSB16

中華人民共和國國家標準

GB/TXXXXX—20XX

食用菌病害檢測鑒定方法

DetectionandIdentificationofDiseasesfromEdibleFungi

（征求意見稿）

20XX-XX-XX發(fā)布20XX-XX-XX實施

國家市場監(jiān)督管理總局

國家標準化管理委員會發(fā)布

1

GB/T××××—20××

食用菌病害檢測鑒定方法

1范圍

本文件明確了食用菌病害的檢測鑒定方法。

本文件適用于國內生產和進口的各類食用菌中真菌病害、細菌病害和病毒病害的檢測鑒

定。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期

的引用文件，僅注日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括

所有的修改單)適用于本文件。

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

GB/T12728食用菌術語

GB19489實驗室生物安全通用要求

GB/T27402實驗室質量控制規(guī)范植物檢疫

GB/T27403實驗室質量控制規(guī)范食品分子生物學檢測

3術語、定義和縮略語

3.1術語和定義

GB/T12728界定的術語和定義適用于本文件。

3.2縮略語

下列縮略語適用于本文件。

Ct：循環(huán)閾值（Cyclethreshold）

CTAB：十六烷基三甲基溴化銨（CetyltrimethylammoniumBromide）

DNA：脫氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid）

NCBI：美國生物技術信息中心（NationalCenterforBiotechnologyInformation）

OD：光密度（OpticalDensity）

PCR：聚合酶鏈式反應（PolymeraseChainReaction）

PDA：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PotatoDextroseAgar）

RNA：核糖核酸（RibonucleicAcid）

RT-PCR：反轉錄聚合酶鏈式反應（ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction）

4總體要求

根據病害種類的不同，一般根據形態(tài)學特征、分子生物學特征、致病性特征、生理生化

特征等進行種類鑒定，需采用多種檢測方法綜合進行結果判定。

3

GB/T××××—20××

在整個試驗操作過程中應采用安全有效的防護措施，具體要求應符合GB19489、GB/T

27402、GB/T27403中的規(guī)定。

5儀器及用具

5.1儀器設備

光照培養(yǎng)箱、高壓滅菌器、超凈工作臺、生物顯微鏡、高速冷凍離心機、純水儀、恒溫

水浴鍋、低溫冰箱、電子天平、酶標儀、PCR儀、熒光定量PCR儀、電泳儀、電泳槽、凝膠成

像分析儀等。

5.2用具

培養(yǎng)皿、燒杯、酒精燈、微型解剖刀、解剖針、吸管、標簽、指形管、鑷子、放大鏡、

載玻片、蓋玻片、記號筆、可調式微量進樣器（2μL、10μL、20μL、100μL、200μL、1000

μL）及相應的進樣槍頭、研缽、離心管（1.5mL、10mL）、PCR管（0.2mL）、量筒、燒

杯等。

5.3試劑

無水乙醇、75%酒精、無菌水、商品化核酸提取試劑盒、PCR反應預混液、瓊脂糖、生理

鹽水、培養(yǎng)基、電泳緩沖液、結晶紫、番紅、七葉靈、檸檬酸鐵、L-色氨酸、酸水解酪素、

果糖、纖維二糖、L-苯丙氨酸、檸檬酸鈉、酒石酸鉀、三水合乙酸鉛、D-半乳糖等。

除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純或生化試劑。實驗用水應符合GB/T6682中的要求。

6現場取樣

盡量從不同部位多點取樣，仔細觀察取回的樣品，看表面是否有腐爛、斑點、變色、異

味、畸形等癥狀，如發(fā)現上述異常，應將樣品送實驗室鑒定。常見重要食用菌病害病狀描述

見附錄A。

7實驗室鑒定

7.1形態(tài)學鑒定

7.1.1真菌病害

用接種針或刀片挑取適量寄主發(fā)病處的疑似病原菌菌絲，或取分離純化后生長4-6天的

病原菌平板培養(yǎng)物用接種針或刀片挑取適量菌絲，在普通光學顯微鏡下觀察病原菌的形態(tài)特

征。隨機選取10-15個視野，測量并觀察病原菌無性態(tài)，如分生孢子器、分生孢子等，以及

有性態(tài)，如子囊殼、子囊孢子等的大小，形態(tài)、顏色等，并進行數碼顯微拍攝，并對測量數

值進行記錄，一般在10×20、10×40放大倍數下進行觀測。對于分離培養(yǎng)的病原菌，同時

觀察菌落的形態(tài)、顏色變化等，并拍照留存。根據權威專著、文獻等參考資料，對病原菌進

行種類鑒定，以明確病原菌的分類地位。

真菌的分離、純化及保存方式見附錄B。

7.1.2細菌病害

將食用菌發(fā)病部位剪成小塊（約0.2cm×0.2cm）進行分離純化，借助光學顯微鏡觀察

病原菌的形態(tài)特征。對于細菌病害，要對其進行染色，觀察其菌體；還可以通過各種染色方

4

GB/T××××—20××

法觀察其是否具有鞭毛、莢膜等，具體方法見附錄C。對所觀察的形態(tài)特征進行拍照留存，

根據權威專著、文獻等參考資料，對病原菌進行種類鑒定，以明確病原菌的分類地位。

細菌的分離、純化及保存方式見附錄B。

7.1.3病毒病害

對于病毒病害，借助電子顯微鏡觀察其形態(tài)特征。對所觀察的形態(tài)特征進行拍照留存，

根據權威專著、文獻等參考資料，對病毒進行種類鑒定，以明確病毒的分類地位。

7.2分子生物學檢測

7.2.1核酸提取

取分離純化得到的真菌或細菌菌落進行DNA提取，疑似病毒病害的樣品一般進行DNA

和RNA提取。核酸提取方法可采用CTAB法、Trizol?法、試劑盒法等，按照不同提取方法的

說明書操作。核酸提取后檢測核酸濃度和純度，并做好記錄，純度較高的DNAOD260/OD280

值應為1.7~1.9，純度較高的RNAOD260/OD280值應為1.8~2.0。提取后的核酸在4℃冰箱保存

備用，長期保存置于-20℃或-80℃冰箱。

7.2.2PCR擴增

根據檢測目的和對象的不同，可采用核酸序列測定、常規(guī)PCR、實時熒光PCR以及

RT-PCR等不同的PCR擴增方法。根據實際情況，選擇一種或多種分子檢測方法。

對于非靶向檢測，采用核酸序列測定的方法，一般適用于真菌病害和細菌病害。常用的

擴增引物如表1所述，具體反應條件和程序的設置，根據不同引物的退火溫度以及PCR反應

酶的說明，進行適當調整。反應過程以目標病原菌的質粒作為陽性對照、健康組織的DNA

作為陰性對照、水作為空白對照。擴增結束后，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，在陽性對照、陰

性對照和空白對照結果均正常的情況下，如待測樣品出現目的條帶，則將PCR產物送至測序

公司進行雙向測序。

表1真菌、細菌常用通用引物信息

適用類群基因引物（5’-3’）目的片段長度

真菌ITSITS1F:CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA~700bp

ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC

ITSITS1:TCCGTAGGTGAACCTGCGC~700bp

ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC

ITSITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC~700bp

ITS5:GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG

LSULROR:GTACCCGCTGAACTTAAGC~900bp

LR5:ATCCTGAGGGAAACTTC

SSU0817F:TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA~380bp

1196R:TCTGGACCTGGTGAGTTTCC

細菌16S8F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG~1500bp

1492R:TACGACTTAACCCCAATCGC

16S16SF:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG~1500bp

16SR:GGTTACCTTGTTACGACTT

16S341F:ACTCCTACGGGAGGCAGCAG~470bp

806R:GGACTACHVGGGTWTCTAAT

cpn60F:GACGTCGCCGGTGACGGCACCACCAC~550bp

R:CGACGGTCGCCGAAGCCCGGGGCCTT

5

GB/T××××—20××

對于靶向檢測，可選擇常規(guī)PCR、實時熒光PCR或RT-PCR等方法。擴增引物/探針選擇

待測目標物種的特異性引物/探針，具體反應條件和程序的設置，根據不同引物/探針的退火

溫度以及PCR反應酶的說明，進行適當調整。特異性引物/探針的應用根據已發(fā)布的標準或

權威文獻進行選擇。反應過程以目標病原菌的質粒作為陽性對照、健康組織的DNA作為陰

性對照、水作為空白對照。擴增結束后，常規(guī)PCR方法進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，實時熒光

PCR方法讀取Ct值。

7.2.3結果分析

對于采用核酸序列測定方法的非靶向檢測：將測序公司返回的單峰序列進行拼接，將拼

接好的序列去除引物后，提交至NCBI數據庫進行序列比對，同時構建系統發(fā)育樹。綜合序

列比對的相似度和系統發(fā)育樹的拓撲結構進行種類判定。如查詢序列與NCBI數據庫中已知

序列相似度高（一般選擇≥98.0%作為閾值）且查詢序列與所有目標物種序列都聚為一個

單系分枝，則可判定查詢序列為該目標物種；否則，需結合形態(tài)學特征進行綜合判定。

對于采用常規(guī)PCR、實時熒光PCR或RT-PCR等方法的靶向檢測：在陽性對照、陰性對

照和空白對照結果均正常的情況下，如待檢測樣品產生特異性擴增條帶，且該條帶與陽性對

照條帶長度一致，則判定檢測結果為陽性，樣品種類為靶向目標物種；或在反應進行40個循

環(huán)的前提下，如Ct值小于35，則判定檢測結果為陽性，樣品種類為靶向目標物種；或根據參

照的標準或文獻中記載的判定原則進行種類判定。

7.3致病性測定

按照科赫氏法則接種，測定病原菌的致病性，具體方法見附錄D。

7.4生理生化測定

對于細菌病害，根據細菌在代謝過程中所產生的合成或分解產物的不同，將分離純化得

到的細菌接種于特定的培養(yǎng)物或檢測管，通過產酸、產氣、顏色變化等反應，檢測細菌的耐

鹽性、好氧性或厭氧性、對碳素化合物的利用和分解能力、對氮素化合物的利用和分解能力、

對大分子化合物的分解能力等，以此確定細菌的種屬。具體測定指標見附錄C。

也可借助生化測定試劑盒、微生物鑒定分析系統（BIOLOG）等進行快速鑒定。

8結果判定

綜合形態(tài)學鑒定、分子生物學檢測、致病性測定和/或生理生化測定結果，進行結果判

定。如多種檢測方法的鑒定結果均符合某一病原菌的性狀，即可判定該病原菌的種類。

9結果記錄

對樣品的基本信息、所采用的檢測方法及依據、使用的儀器設備、檢測結果、結果判定、

檢測人員信息、檢測日期、檢測單位等進行詳細記錄。結果記錄內容應包括但不限于：

10樣品保存

保存可重復檢測結果的所有材料，如剩余樣品、核酸、分離純化后得到的菌種等；一般

保存期至少1年，以備復驗、談判和仲裁。

6

GB/T××××—20××

AA

附錄A

（資料性）

常見重要食用菌病害病狀描述

A.1真菌病害

A.1.1濕腐病MycogoneperniciosaMagnus

又稱褐腐病、濕泡病，為寄生性病害，發(fā)生普遍。只危害子實體，不侵染菌絲體。發(fā)病

輕的菌梗腫大成泡狀，發(fā)病重的形成畸形菇。子實體未分化時被感染，形成不規(guī)則形似馬勃

狀的組織塊，上面覆蓋一層白色絨毛狀菌絲，后變暗褐色；子實體分化后被感染，菌梗變褐

色。

A.1.2輪枝霉病Verticilliumspp.

也稱干泡病、褐斑病，為寄生性病害。在蘑菇收獲期間過度的潮濕加上空氣不流通助長

了該病的發(fā)生。輕度受感染的病菇表現為在發(fā)育中的原基菌柄的基部和上部以及菌蓋上出現

褐色斑點或條痕，受侵染的蘑菇時常向一側彎曲，成熟的病菇呈現出畸形的菌蓋，有時具有

一“毛唇”。病菇內部整個組織干燥而呈黃褐色皮革質且有彈性，始終不臭不爛。

A.1.3胡桃肉狀菌病Diehliomycesmicrosporus(Diehl.etLambert)Gilkey

也稱塊菌病、花菜病，是危害雙孢蘑菇最大的競爭性真菌，也可以抑制蘑菇菌絲生長，

危害嚴重時可造成絕收。該病最早發(fā)現于北美的蘑菇房內，現廣泛分布于全世界雙孢蘑菇生

產國家。該真菌菌絲的形態(tài)與蘑菇相似，但可嗅到較濃的漂白粉氣味，子實體直徑0.5~3cm，

群生，近球形、不規(guī)則形至盤形，表面有不規(guī)則的腦狀皺紋，形似胡桃仁，白色至紅褐色。

菌塊解體后，子囊孢子散落在覆土、培養(yǎng)料及床架上，成為下一季的主要污染源。

A.1.4綠木霉病TrichodermaviridePers.exFr.

綠霉又名木霉。是食用菌生產中危害最大的競爭性雜菌，尤其是困擾香菇菌棒生產的雜

菌病害。綠霉的寄主范圍很廣，幾乎危害所有的食用菌；分布范圍很大，是世界性的食用菌

危害菌；危害期長，食用菌的整個生產過程都會受到侵害；危害程度大，嚴重時可使整批食

用菌絕收。初期菌絲為白色、細而密，逐漸變?yōu)闇\綠色。菌落中央為深綠色，邊緣呈白色。

后期變?yōu)樯罹G色，嚴重時使整個菌袋全部變?yōu)槟G色。

A.1.5曲霉病Aspergillusspp.

曲霉種類繁多，常見的有白曲霉、黃曲霉、黑曲霉、紅曲霉等。曲霉菌絲有隔、無色、

淡色或表面凝集有色物質，分生孢子梗直立生長，不分枝，梗頂端膨大成球形或棍棒形的頂

囊，其表面生滿輻射狀小梗，在小梗頂端串生分生孢子。分生孢子單胞，球形、卵圓形或橢

圓形，孢子呈黃、綠、褐、黑等各種顏色，菌落顏色因不同種而各異，分生孢子隨空氣氣流

飄浮擴散。曲霉菌絲短而粗。

A.1.6青霉病Penicilliumspp.

青霉病也叫藍綠霉。是食用菌制種過程中常見的污染雜菌，主要危害各種食用菌的菌絲

體。青霉常污染菌種和菌袋。侵染幼菇發(fā)病一般頂部呈黃褐色枯萎，生長停止，表面很快長

7

GB/T××××—20××

出綠色粉狀霉層，其鄰近的正常生長的健菇可被傳染。菌柄基部呈黃褐色腐爛，很快長了綠

色粉狀霉層。金針菇基腐病，子實體生長發(fā)育階段，菌柄基部變黑褐色至黑色腐爛，基部腐

爛后子實體倒伏。幼菇叢發(fā)病雖不倒伏，但不能繼續(xù)向上生長發(fā)育。嚴重發(fā)生時，針狀的幼

菇成叢變黑腐爛。

A.1.7絲枝霉病Aphanocladiumspp.

又叫斑點病或凹斑病。主要危害雙孢菇子實體，少量寄生于香菇、白靈菇、平菇和猴頭

菇等。子實體感病后在菌蓋和菌柄上會出現褐色稍凹陷的病斑，病斑形狀大小不一、邊緣色

較深。潮濕條件下長出灰白色的霉狀物，即病菌的分生孢子梗和分生孢子。菌肉組織潰爛、

病斑有時出現裂紋。

A.1.8褶霉病Cephalosporiumspp.

褶霉病除危害雙孢菇外還可危害香菇、白靈菇、茶樹菇等。病原菌侵染蘑菇子實體的菌

褶和菌蓋，尤其是菌褶受害后癥狀明顯。發(fā)病部位的菌褶連在一起，并出現雜色斑紋。子實

體變形。菌蓋上的癥狀為暗褐色斑點，病斑組織變硬，菌肉一般腐爛。

A.1.9枯萎病Fusariumspp.

又稱萎縮病、猝倒病。可危害雙孢菇、白靈菇、平菇、銀耳等食用菌子實體。蘑菇子實

體被侵染后生長發(fā)育受阻，顏色淡黃。菌柄從外到內變褐，有的整個菇體變褐，干腐但不爛。

平菇幼菇受害，停止生長，呈黃褐色萎縮，直至幼菇枯萎死亡。高濕條件下，病菇菌柄基部

可見白色菌絲和粉狀物。

A.2細菌病害

A.2.1細菌性褐斑病Pseudomonasspp.

又稱細菌性斑點病、細菌性麻臉病，為寄生性病害。在蘑菇子實體表面出現圓形或不規(guī)

則形的黃色病斑，尤其在濕蘑菇上繁殖迅速。隨著年齡增大，病斑變成褐色且有粘液，同時

具有強烈的臭味。

A.2.2金針菇褐腐病Erwiniaspp.

金針菇子實體被感染后，菌蓋、菌柄上都能形成褐色斑點，然后腐爛。這種病菌還能溶

解金針菇的菌絲，危害極大。

A.2.3杏鮑菇黃萎病Pantoeaspp.

侵染初期在菌蓋或菌柄上形成水漬狀病斑，病斑逐漸擴大，導致菌蓋或菌柄腐爛，有膿

狀物產生。

A.3病毒病害

A.3.1法蘭西病毒病LaFranceIsometricVirus(LIV)

又稱頂死病、木乃伊病，由病毒引起的寄生性病害，引起菌株變質。當病毒侵入整個菌

絲體時，菌絲體生長速度減慢，一般不能形成子實體，少數形成的子實體表現矮小、畸形或

死亡。

8

GB/T××××—20××

A.3.2香菇病毒病

香菇帶毒是香菇栽培中的常見問題，香菇感染病毒后的癥狀主要表現為菌絲生長緩慢、

長勢減弱、子實體畸形、質量和產量降低等。國內外的研究人員先后從生長不正常的香菇子

實體和菌絲體中分離到了包括球狀、桿狀和蝌蚪狀（噬菌體）的病毒顆粒或類似病毒顆粒

VirusLikeParticles(VLPs)。

A.3.3側耳病毒病

病害癥狀因病原不同而表現為子實體畸形或不顯癥，但產量均顯著下降。病毒主要有與

法蘭西病毒病相關的糙皮側耳球形病毒（oystermushroomsphericalvirus，OMSV）、感染后

不產生明顯癥狀的糙皮側耳病毒Ⅰ（PleurotusostreatusvirusⅠ，PoVⅠ）、感染后在菌絲體和子

實體階段均出現明顯表型不正常癥狀的糙皮側耳等軸狀病毒（oystermushroomisometric

virus，OMIV）以及在糙皮側耳菌株（Shin-Nong）上發(fā)現的糙皮側耳病毒SN（Pleurotus

ostreatusvirusSN，PoV-SN）病毒。

9

GB/T××××—20××

附錄B

（資料性）

病原菌的分離、純化及保存方式

B.1真菌的分離、純化及保存方式

選取發(fā)病部位，直接刮取病原菌霉層放在PDA培養(yǎng)基上，于26℃黑暗條件下培養(yǎng)，3-7

天后用接種鉤挑取病原菌邊緣菌落至PDA平板上進行純化，5-7天后將純化的病原菌轉接至

PDA斜面培養(yǎng)基中4℃保存。

B.2細菌的分離、純化及保存方式

將食用菌發(fā)病部位剪成小塊（約0.2cm×0.2cm），用75%酒精消毒5-10s，再用無菌水

漂洗兩次，然后在無菌條件下將發(fā)病組織搗碎，取組織液在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)

（28℃）。待長出單菌落后挑取單菌落進行純化。

病原細菌液體搖床培養(yǎng)后（170rpm，26℃），使之濃度達到3×108cfu/ml。然后取搖

好的液體培養(yǎng)物0.5ml轉移到滅菌的細菌保存管中，加入等體積的40%甘油，密封保存在

-20℃甘油中。

10

GB/T××××—20××

附錄C

（資料性）

病原細菌的形態(tài)學觀察及生理生化指標測定

C.1形態(tài)學觀察

C.1.1革蘭氏染色

（1）制片：取24h菌種培養(yǎng)物常規(guī)涂片、干燥、固定；

（2）初染：滴加結晶紫染色1-2min，水洗；

（3）媒染：用碘液沖去殘水，并用碘液覆蓋約1min，水洗；

（4）脫色：用濾紙吸去玻片上的殘水，將玻片傾斜，用滴管流加95%乙醇脫色20-30s

直至流出的乙醇無紫色，立即水洗；

（5）復染：用番紅液復染約2min，水洗。

玻片干燥后，用100×油鏡觀察，并照相。

以金黃色葡萄球菌為陽性對照菌，以大腸埃希氏菌為陰性對照菌。深紫色為革蘭氏染色

陽性細菌；紅色為革蘭氏染色陰性細菌。

C.1.2運動性（半固體瓊脂穿刺法）

根據有鞭毛的細菌可以在半固體培養(yǎng)基中游動但又不能任意游走的想象，觀察細菌的生

長情況，判定試驗菌是否有運動性?？墒褂迷囼灳芰己蒙L的培養(yǎng)基，在其中加0.3%-0.6%

的瓊脂，一般半固體培養(yǎng)基應是放倒試管不流動，而在手上輕輕敲打時瓊脂即破裂為宜。

用直針穿刺接種試驗菌于半固體培養(yǎng)基上，適溫培養(yǎng)。細菌的運動性可用透射光目測。

如生長物只生長在穿刺線上，邊緣十分清晰，則表示試驗菌無運動性；如生長物由穿刺線向

四周呈云霧狀擴散，其邊緣呈云霧狀，則表示試驗菌株有運動性。

對于生長較快的細菌應培養(yǎng)1天后觀察；如第一天不能判定可在第2-3天再觀察；如2-3

天時仍不能判定是否具有流動性，可延遲5-6天再觀察一次。如試驗菌在半固體培養(yǎng)基中產

氣，氣泡會使穿刺線上的生長物產生擴散情況，不可誤判為有運動性。如試驗菌是好氧菌，

穿刺線上生長物很少，可檢查從培養(yǎng)基表面向下深入的生長物的情況。

C.2生理生化指標測定

C.2.1菌落形態(tài)觀察

取一點菌苔或一環(huán)細菌懸液，在倒好的無冷凝水的平板一側邊緣處，反復涂抹直徑大約

為1cm大小的面積；燒灼接種環(huán)，冷卻后，從上述涂菌處劃出7-8條直線，前3-4條線從涂菌

處劃出，后3-4條直線可不通過涂菌處，劃線時接種環(huán)與平板表面成30°-40°角，輕輕接觸，

不要使接種環(huán)劃破表面；上述燒灼、劃線操作再重復數次，以劃滿整個平板為宜。倒置平板。

適宜溫度培養(yǎng)1-2天，出現單菌落。觀察形狀、大小、邊緣、表面、隆起形狀、透明度、

菌落及培養(yǎng)基的顏色。

C.2.2丙二酸利用

11

GB/T××××—20××

用幼齡菌種接種，適溫培養(yǎng)1-2天，培養(yǎng)基由綠變藍為陽性，培養(yǎng)基不變色為陰性，同

時不加丙二酸作為空白對照。

C.2.3耐鹽性和需鹽性

取幼齡菌種液接種至不同濃度NaCl（2%、5%、7%、10%）培養(yǎng)，3和7天分別觀察，與

未接種的對照管對比，觀察生長情況。

C.2.4熒光色素

以24h菌齡的培養(yǎng)物接種于熒光色素培養(yǎng)基斜面，置于30℃培養(yǎng)1、3、5天后，在紫外

燈下觀察有無熒光。

C.2.5氧化酶

在干凈培養(yǎng)皿里放一張濾紙，滴上二甲基對苯撐二胺的1%水溶液，僅使濾紙濕潤即可。

用滅菌的牙簽取18-24h的菌苔，涂抹在濕潤的濾紙上，在10s內涂抹的菌苔現紅色為陽性，

10-60s現紅色為延遲反應，60s以上現紅色則不計，按陰性處理。

C.2.6葡萄糖氧化發(fā)酵

以18-24h幼齡菌作種子，穿刺接種，每株4支。其中2支用滅菌的凡士林石蠟油（熔化

的2/3凡士林中加入1/3液體石蠟，高壓滅菌）封蓋，約0.5~1cm厚，以隔絕空氣為閉管。另2

支不封油為開管，同時還要有不接種的閉管和開管作對照。室溫培養(yǎng)1、2、3、7、14天觀察

結果。

只有開管產酸變黃者為氧化型，開管和閉管均產酸變黃者為發(fā)酵型。

C.2.7接觸酶

以24h培養(yǎng)的斜面菌種以接種環(huán)取一小環(huán)涂抹于已滴有3%過氧化氫的玻片上，如有氣

泡產生為陽性，無氣泡為陰性。

C.2.8淀粉水解

取新鮮斜面培養(yǎng)物點種于淀粉水解培養(yǎng)基上，適溫培養(yǎng)。培養(yǎng)2-5天，形成明顯菌落后，

在平板上滴加碘液，平板呈藍黑色，菌落周圍如有不變色透明圈，表示淀粉水解陽性，仍是

藍黑色為陰性。

C.2.9檸檬鹽酸利用

在斜面上劃線接種，適溫培養(yǎng)3-7天。培養(yǎng)基為堿性（指示劑藍色或桃紅色）為陽性，

否則為陰性。

C.2.10七葉靈水解

取新鮮菌種接種后，適溫培養(yǎng)3、7、14天觀察。產黑褐色色素者為陽性，不產黑褐色色

素者為陰性。

C.2.11脲酶

將測試菌接種在營養(yǎng)瓊脂斜面。在第3和7天進行脲酶測定。在空試管中，將斜面菌苔做

成2ml濃菌懸液，加入一滴酚紅指示劑，調pH到7，即酚紅剛剛轉黃呈橙紅色，再分作兩份，

12

GB/T××××—20××

在其中的一管加入少許結晶的尿素0.05-0.1g，另一管不加尿素作為對照。如加尿素的試管

幾分鐘變堿，酚紅指示劑變紅，表示測定菌為脲酶陽性，不變則為陰性。

C.2.12色氨酸脫氨酶（吲哚產物）

將菌株的幼齡培養(yǎng)物接種于培養(yǎng)液中，適溫培養(yǎng)24h，取2-4滴培養(yǎng)液，與1滴三氯化鐵

溶液（33%）相混。如呈紅褐色，則為色氨酸脫氨酶陽性，無顏色變化則為陰性。

C.2.13酒石酸鹽利用

取新鮮培養(yǎng)物接種（如時間超過14天，需水溶煮沸10min），每天觀察顏色變化，接種

后14天，加入等體積的醋酸鉛試劑，同時有不接種的作為對照。

如顏色呈綠黃色，有少量醋酸鉛沉淀，則為陽性；如為藍色或綠色，大量的醋酸鉛沉淀，

則為陰性。

C.2.14生長溫度和耐熱性

最高、最適、最低和耐受溫度能力的特征常常是某些細菌的鑒定特征之一，設定測定溫

度為4℃、20℃、30℃、37℃和41℃。

以液體培養(yǎng)物（24h培養(yǎng)物）以小環(huán)轉入澄清LB培養(yǎng)基，置于不同溫度培養(yǎng)。37℃以

上的測定置于水浴中，需3次移種生長者才能確認。

C.2.15糖、醇類發(fā)酵

以幼齡培養(yǎng)物穿刺接種斜面培養(yǎng)基，適溫培養(yǎng)，1、3、5天分別觀察，如指示劑變黃，

表示產酸，為陽性；不變或變藍（紫）則為陰性。

C.2.16脂酶

劃線接種培養(yǎng)物于平板，培養(yǎng)至7天，每天觀察。在生長的周圍有模糊的暈圈者為陽性，

沒有暈圈者為陰性。

C.2.17硫化氫

（1）紙條法

將純培養(yǎng)物接種到新鮮斜面培養(yǎng)基。接種后，用無菌鑷子夾取一條醋酸鉛試紙條用棉塞

塞緊，使懸掛于管中，下端接近培養(yǎng)基表面，不接觸液面，適溫培養(yǎng)。于接種后3、7、14

天觀察。試紙條變黑色者為陽性，不變者為陰性。

此方法較敏感，不適用于腸桿菌科。紙條高度應放置適當，離液面太遠影響靈敏度，太

近容易濺濕，同時移動試管架時也要平穩(wěn)。

（2）腸桿菌

用穿刺法接種，30℃培養(yǎng)，分別于1、3、7天觀察，變黑者為陽性，不變者為陰性。

C.2.18吲哚

把新鮮的菌種接種于培養(yǎng)基中，適溫培養(yǎng)。分別測定培養(yǎng)1、2、4、7天的培養(yǎng)液。

沿試管壁緩緩加入3-5mm高的試劑與培養(yǎng)液表面，在溶液層界面發(fā)生紅色，即為陽性

反應；若顏色不明顯，可加4-5滴乙醚至培養(yǎng)液，搖動，使乙醚分散于液體中，將培養(yǎng)液靜

置片刻，待乙醚浮至液面后再加吲哚試劑；如培養(yǎng)液中有吲哚，其可被提取在乙醚層中，濃

縮的吲哚和試劑反應，則顏色明顯。

C.2.19硝酸鹽還原

13

GB/T××××—20××

將菌種接種于硝酸鹽液體培養(yǎng)基中，每個菌做兩個重復，另外設置兩管不接種的作為對

照。

適溫培養(yǎng)1、3、5天調查。在比色瓷盤小窩中倒入少許培養(yǎng)1、3、5天的培養(yǎng)液，再加一

滴格里斯氏試劑，在對照觀眾同樣加入一滴格里斯氏試劑。加入格里斯氏試劑后，溶液如變

為粉紅色、玫瑰紅色、橙色、棕色等，表示亞硝酸鹽存在，為硝酸鹽還原陽性。如無紅色出

現，則可加一、兩滴二苯胺試劑，此時如呈藍色反應，則表示培養(yǎng)液中仍有硝酸鹽，無亞硝

酸鹽反應，表示無硝酸鹽還原作用；如不呈藍色反應，表示硝酸鹽和形成的亞硝酸鹽都已還

原成其他物質，故仍按硝酸鹽還原陽性處理。

還原硝酸鹽反應是在較為厭氧條件下進行的，但分裝試管時液層不宜太薄，對生長緩慢

的細菌尤應注意。對未呈現亞硝酸鹽反應的測定應檢查是否仍有硝酸鹽（二苯胺測定），然

后才能判斷有無硝酸鹽的還原反應。

C.2.20明膠液化

取18-24h的斜面培養(yǎng)物穿刺接種，并有兩支未接種的作為空白對照。

在20℃溫箱中培養(yǎng)，2、7、14和30天調查。在20℃以下的室溫觀察生長情況及明膠是否

液化。如菌已生長，明膠表明無凹陷且為穩(wěn)定的凝塊，則為明膠水解陰性。如明膠凝塊部分

或全部在20℃以下變?yōu)榭闪鲃拥囊后w，則為明膠水解陽性。如菌已生長，明膠未液化，但明

膠表面菌苔下出現凹陷小窩（須與未接種的對照管比較，因培養(yǎng)過久的明膠因水分散失也會

凹陷）也是輕度水解，按陽性記錄。

如有的菌在20℃不生長，則在30℃培養(yǎng)生長后，觀察時放冰箱或冷水中降溫，待對照管

凝固后再記錄。明膠質量不一，以在20℃時凝固成穩(wěn)定的凝塊為宜。

C.2.21苯丙氨酸脫氨酶

適當的濃度接種，37℃培養(yǎng)4h或8-24h測定。

將4-5滴試劑滴到生長菌的斜面上，當斜面上和冷凝水中產生綠色時則為陽性反應，即

表明與形成了苯丙酮酸，不變則為陰性。

14

GB/T××××—20××

附錄D

（資料性）

致病性測定

D.1真菌致病性測定

（1）將供試真菌轉接到PDA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)5-7天，取菌絲生長情況基本一致的部位，

用打孔器打成菌片（直徑3mm左右）；

（2）將報紙平鋪在保濕盒中，噴水保濕，然后放入試管。將預先清洗好的子實體分組

放入保濕盒中，以備接種，每組的子實體菌蓋大小接近；

（3）將打好的菌片貼在子實體菌蓋上，每株真菌三組重復。以打好的PDA培養(yǎng)基片貼

在子實體菌蓋上做對照；

（4）接種后每天觀察發(fā)病情況；

（5）將發(fā)病子實體上的致病菌分離純化，看是否與接種菌一致。

D.2細菌致病性測定

（1）將保存在甘油中的細菌轉移到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基上，170rpm，26℃培養(yǎng)，

每個菌株轉接一瓶培養(yǎng)基（約100ml）即可。待菌懸液渾濁后（1-2天）即可接種；

（2）將已經生長好的未知濃度的菌懸液按照麥法蘭云度計配置成所需要的濃度：2×109

個/ml；

（3）菌懸液配好后，采用涂抹法接種；

（4）觀察發(fā)病情況，記錄病級。發(fā)病嚴重程度用發(fā)病的病斑占子實體的百分率計算。

分級標準如下：

0級：子實體上無病斑；

1級：病斑占子實體面積的5%以下；

3級：病斑占子實體面積的6%-10%；

5級：病斑占子實體面積的11%-25%；

7級：病斑占子實體面積的26%-50%；

9級：病斑占子實體面積的51%以上。

（5）從發(fā)病的子實體上再次分離致病菌，如果能再次分離到原致病菌，則可確定這株

細菌為病原菌。

15

GB/T××××—20××

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)

則》的規(guī)定起草。

請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文的發(fā)布機構不承擔識別這些專利的責任。

本文件由全國植物檢疫標準化技術委員會（SAC/TC271）提出并歸口。

本文件起草單位：中國檢驗檢疫科學研究

本文件主要起草人：王聰、姜帆、吳品珊、黃英、田茜

2

GB/T××××—20××

食用菌病害檢測鑒定方法

1范圍

本文件明確了食用菌病害的檢測鑒定方法。

本文件適用于國內生產和進口的各類食用菌中真菌病害、細菌病害和病毒病害的檢測鑒

定。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期

的引用文件，僅注日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括

所有的修改單)適用于本文件。

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

GB/T12728食用菌術語

GB19489實驗室生物安全通用要求

GB/T27402實驗室質量控制規(guī)范植物檢疫

GB/T27403實驗室質量控制規(guī)范食品分子生物學檢測

3術語、定義和縮略語

3.1術語和定義

GB/T12728界定的術語和定義適用于本文件。

3.2縮略語

下列縮略語適用于本文件。

Ct：循環(huán)閾值（Cyclethreshold）

CTAB：十六烷基三甲基溴化銨（CetyltrimethylammoniumBromide）

DNA：脫氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid）

NCBI：美國生物技術信息中心（NationalCenterforBiotechnologyInformation）

OD：光密度（OpticalDensity）

PCR：聚合酶鏈式反應（PolymeraseChainReaction）

PDA：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PotatoDextroseAgar）

RNA：核糖核酸（RibonucleicAcid）

RT-PCR：反轉錄聚合酶鏈式反應（ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction）

4總體要求

根據病害種類的不同，一般根據形態(tài)學特征、分子生物學特征、致病性特征、生理生化

特征等進行種類鑒定，需采用多種檢測方法綜合進行結果判定。

3

GB/T××××—20××

在整個試驗操作過程中應采用安全有效的防護措施，具體要求應符合GB19489、GB/T

27402、GB/T27403中的規(guī)定。

5儀器及用具

5.1儀器設備

光照培養(yǎng)箱、高壓滅菌器、超凈工作臺、生物顯微鏡、高速冷凍離心機、純水儀、恒溫

水浴鍋、低溫冰箱、電子天平、酶標儀、PCR儀、熒光定量PCR儀、電泳儀、電泳槽、凝膠成

像分析儀等。

5.2用具

培養(yǎng)皿、燒杯、酒精燈、微型解剖刀、解剖針、吸管、標簽、指形管、鑷子、放大鏡、

載玻片、蓋玻片、記號筆、可調式微量進樣器（2μL、10μL、20μL、100μL、200μL、1000

μL）及相應的進樣槍頭、研缽、離心管（1.5mL、10mL）、PCR管（0.2mL）、量筒、燒

杯等。

5.3試劑

無水乙醇、75%酒精、無菌水、商品化核酸提取試劑盒、PCR反應預混液、瓊脂糖、生理

鹽水、培養(yǎng)基、電泳緩沖液、結晶紫、番紅、七葉靈、檸檬酸鐵、L-色氨酸、酸水解酪素、

果糖、纖維二糖、L-苯丙氨酸、檸檬酸鈉、酒石酸鉀、三水合乙酸鉛、D-半乳糖等。

除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純或生化試劑。實驗用水應符合GB/T6682中的要求。

6現場取樣

盡量從不同部位多點取樣，仔細觀察取回的樣品，看表面是否有腐爛、斑點、變色、異

味、畸形等癥狀，如發(fā)現上述異常，應將樣品送實驗室鑒定。常見重要食用菌病害病狀描述

見附錄A。

7實驗室鑒定

7.1形態(tài)學鑒定

7.1.1真菌病害

用接種針或刀片挑取適量寄主發(fā)病處的疑似病原菌菌絲，或取分離純化后生長4-6天的

病原菌平板培養(yǎng)物用接種針或刀片挑取適量菌絲，在普通光學顯微鏡下觀察病原菌的形態(tài)特

征。隨機選取10-15個視野，測量并觀察病原菌無性態(tài)，如分生孢子器、分生孢子等，以及

有性態(tài)，如子囊殼、子囊孢子等的大小，形態(tài)、顏色等，并進行數碼顯微拍攝，并對測量數

值進行記錄，一般在10×20、10×40放大倍數下進行觀測。對于分離培養(yǎng)的病原菌，同時

觀察菌落的形態(tài)、顏色變化等，并拍照留存。根據權威專著、文獻等參考資料，對病原菌進

行種類鑒定，以明確病原菌的分類地位。

真菌的分離、純化及保存方式見附錄B。

7.1.2細菌病害

將食用菌發(fā)病部位剪成小塊（約0.2cm×0.2cm）進行分離純化，借助光學顯微鏡觀察

病原菌的形態(tài)特征。對于細菌病害，要對其進行染色，觀察其菌體；還可以通過各種染色方

4

GB/T××××—20××

法觀察其是否具有鞭毛、莢膜等，具體方法見附錄C。對所觀察的形態(tài)特征進行拍照留存，

根據權威專著、文獻等參考資料，對病原菌進行種類鑒定，以明確病原菌的分類地位。

細菌的分離、純化及保存方式見附錄B。

7.1.3病毒病害

對于病毒病害，借助電子顯微鏡觀察其形態(tài)特征。對所觀察的形態(tài)特征進行拍照留存，

根據權威專著、文獻等參考資料，對病毒進行種類鑒定，以明確病毒的分類地位。

7.2分子生物學檢測

7.2.1核酸提取

取分離純化得到的真菌或細菌菌落進行DNA提取，疑似病毒病害的樣品一般進行DNA

和RNA提取。核酸提取方法可采用CTAB法、Trizol?法、試劑盒法等，按照不同提取方法的

說明書操作。核酸提取后檢測核酸濃度和純度，并做好記錄，純度較高的DNAOD260/OD280

值應為1.7~1.9，純度較高的RNAOD260/OD280值應為1.8~2.0。提取后的核酸在4℃冰箱保存

備用，長期保存置于-20℃或-80℃冰箱。

7.2.2PCR擴增

根據檢測目的和對象的不同，可采用核酸序列測定、常規(guī)PCR、實時熒光PCR以及

RT-PCR等不同的PCR擴增方法。根據實際情況，選擇一種或多種分子檢測方法。

對于非靶向檢測，采用核酸序列測定的方法，一般適用于真菌病害和細菌病害。常用的

擴增引物如表1所述，具體反應條件和程序的設置，根據不同引物的退火溫度以及PCR反應

酶的說明，進行適當調整。反應過程以目標病原菌的質粒作為陽性對照、健康組織的DNA

作為陰性對照、水作為空白對照。擴增結束后，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，在陽性對照、陰

性對照和空白對照結果均正常的情況下，如待測樣品出現目的條帶，則將PCR產物送至測序

公司進行雙向測序。

表1真菌、細菌常用通用引物信息

適用類群基因引物（5’-3’）目的片段長度

真菌ITSITS1F:CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA~700bp

ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC

ITSITS1:TCCGTAGGTGAACCTGCGC~700bp

ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC

ITSITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC~700bp

ITS5:GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG

LSULROR:GTACCCGCTGAACTTAAGC~900bp

LR5:ATCCTGAGGGAAACTTC

SSU0817F:TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA~380bp

1196R:TCTGGACCTGGTGAGTTTCC

細菌16S8F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG~1500bp

1492R:TACGACTTAACCCCAATCGC

16S16SF:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG~1500bp

16SR:GGTTACCTTGTTACGACTT

16S341F:ACTCCTACGGGAGGCAGCAG~470bp

806R:GGACTACHVGGGTWTCTAAT

cpn60F:GACGTCGCCGGTGACGGCACCACCAC~550bp

R:CGACGGTCGCCGAAGCCCGGGGCCTT

5

GB/T××××—20××

對于靶向檢測，可選擇常規(guī)PCR、實時熒光PCR或RT-PCR等方法。擴增引物/探針選擇

待測目標物種的特異性引物/探針，具體反應條件和程序的設置，根據不同引物/探針的退火

溫度以及PCR反應酶的說明，進行適當調整。特異性引物/探針的應用根據已發(fā)布的標準或

權威文獻進行選擇。反應過程以目標病原菌的質粒作為陽性對照、健康組織的DNA作為陰

性對照、水作為空白對照。擴增結束后，常規(guī)PCR方法進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，實時熒光

PCR方法讀取Ct值。

7.2.3結果分析

對于采用核酸序列測定方法的非靶向檢測：將測序公司返回的單峰序列進行拼接，將拼

接好的序列去除引物后，提交至NCBI數據庫進行序列比對，同時構建系統發(fā)育樹。綜合序

列比對的相似度和系統發(fā)育樹的拓撲結構進行種類判定。如查詢序列與NCBI數據庫中已知

序列相似度高（一般選擇≥98.0%作為閾值）且查詢