DB21∕T 1958-2012 水產(chǎn)動物 DNA鑒定 線粒體COI基因序列法

ICSFORMTEXT65.150FORMTEXTB50FORMTEXTDBFORMTEXT21DBFORMTEXT21/FORMTEXTT1958—FORMTEXT2012FORMTEXTFORMTEXT水產(chǎn)動物DNA鑒定線粒體COI基因序列法FORMTEXTMitochondrialCOIgenetodetectgermplasmforaquaculturespeciesFORMTEXT點(diǎn)擊此處添加與國際標(biāo)準(zhǔn)一致性程度的標(biāo)識FORMDROPDOWNFORMTEXT（本稿完成日期：2011-12-20）FORMTEXT2012–FORMTEXT02–FORMTEXT20發(fā)布FORMTEXT2012–FORMTEXT03–FORMTEXT20實(shí)施FORMTEXT遼寧省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布DB21/XXXXX—XXXXI前言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院提出。本標(biāo)準(zhǔn)由遼寧省海洋與漁業(yè)廳歸口。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草單位：遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：赫崇波，李云峰，劉衛(wèi)東，高祥剛，鮑相勃，蘇浩。本標(biāo)準(zhǔn)首次發(fā)布。水產(chǎn)動物DNA鑒定線粒體COI基因序列法范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了水產(chǎn)動物DNA鑒定線粒體COI基因序列法的原理、試劑、儀器、分析步驟和結(jié)果判定。本標(biāo)準(zhǔn)適用于水產(chǎn)動物DNA鑒定等方面的種質(zhì)檢驗(yàn)工作。規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GA/T383-2002法庭科學(xué)DNA實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)范SN/T1193-2003基因檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求術(shù)語、定義和縮略語下列術(shù)語、定義和縮略語適用于本標(biāo)準(zhǔn)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction,PCR)用一對寡核苷酸引物、四種脫氧核糖核苷酸（dNTPs）為原料，在合適的溫度、離子條件和耐熱DNA聚合酶催化下，在體外人工合成特異的DNA片段的過程。細(xì)胞色素c氧化酶亞基I(CytochromeCoxidaseI,COI)線粒體(mitochondrion)真核細(xì)胞中由雙層高度特化的單位膜圍成的細(xì)胞器。DNA序列測定(DNAsequencing)測定DNA分子的核苷酸序列。序列比對(alignment)為確定兩個(gè)或多個(gè)序列之間的相似性以至于同源性，而將他們按照一定的規(guī)律排列。原理線粒體COI基因是位于線粒體DNA的蛋白質(zhì)編碼基因，其長度為600bp左右易于擴(kuò)增，進(jìn)化速度較快同時(shí)又相對保守，既有足夠的變異又便于通用引物擴(kuò)增，DNA序列很少有插入與缺失現(xiàn)象，便于序列比對分析。利用通用引物對水產(chǎn)動物線粒體COI進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到目的片段進(jìn)行純化、測序，只要將所有序列進(jìn)行兩兩比較并計(jì)算其差異值，然后根據(jù)差異值來確定物種之間的關(guān)系。試劑裂解液核苷酸(RNA)酶三羥甲基氨基甲烷飽和酚(Tris飽和酚)三氯甲烷異戊醇無水乙醇溴化乙錠（10mg/mL）10×Tris硼酸(10×TBE)電泳緩沖液6上樣緩沖液100bpDNA分子量標(biāo)記瓊脂糖：分析純蛋白酶K（20mg/mL）TaqDNA聚合酶（5U/L）分子量標(biāo)準(zhǔn)(markers)超純水儀器凝膠成像分析系統(tǒng)PCR儀低溫高速離心機(jī)穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀單道可調(diào)移液器（2L，10L，20L，電子天平（量程0.01-300mg）水浴恒溫震蕩器電泳槽普通離心機(jī)紫外分光光度計(jì)超聲波清洗器超純水器遺傳分析儀分析步驟鑒定樣品待鑒定樣品可以是皮毛、肌肉、骨骼、各種器官、組織、血液等，可以通過冷凍、冰鮮、酒精保存。鑒定材料處理通過現(xiàn)場或?qū)嶒?yàn)室取樣，將采集到的樣品（如：肌肉、肝臟、魚卵、魚鰭等）用蒸餾水洗凈后放入盛有75％酒精的離心管中，4℃保存待用基因組DNA的提取把取回樣品用蒸餾水洗凈后，用標(biāo)準(zhǔn)的SDS變性（或CTAB變性）、蛋白酶K消化和酚／氯仿抽提方法提取總DNA，具體操作參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南（第3版）》等的方法沉淀DNA，收集絮狀沉淀，用70%乙醇洗滌兩次，室溫干燥后加入適量TE溶解DNA。DNA純度檢測吸取1-3μL提取的DNA，用1–2％瓊脂糖凝膠100V電泳30min，檢測所提取DNA的質(zhì)量。如果DNA條帶比較整齊、亮度較高，則說明提取的DNA質(zhì)量較好。DNA濃度檢測紫外吸收定性測試分別于260nm波長和280nm波長下測定產(chǎn)物（或產(chǎn)物稀釋液）的紫外吸收值。確定A260／A280比值在1.8–2.0范圍內(nèi)，方可正常進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。紫外吸收定量測試DNA濃度(μg/mL)=[A260／(0.020×L)]×稀釋倍數(shù)，式中A260為被測樣品在260nm波長下的吸光度值，L為比色池厚度，單位cm。應(yīng)保證DNA濃度在10μg/mL以上，方可正常進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。線粒體特異性引物設(shè)計(jì)采用無脊椎動物通用引物正向(F)：GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG；反向(R)：TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA。魚類正向引物：TCAACCAACCACAAAGACATTGGC；反向引物：TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA。線粒體DNA片段擴(kuò)增和測序利用設(shè)計(jì)好的線粒體特異性引物，對提取的DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對得到的特異性PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收和純化后，用遺傳分析儀進(jìn)行PCR產(chǎn)物直接雙向測序。數(shù)據(jù)分析和種類鑒定利用NCBI(美國國立生物技術(shù)信息中心)的GenBank數(shù)據(jù)庫的Blastn基因搜索程序?qū)Υb定個(gè)體的DNA序列進(jìn)行比對分析，根據(jù)差異值來確定物種之間的關(guān)系。一般情況下，序列相似度≥98%確定為同一物種。同一種水產(chǎn)動物由于不同的地理種群的遺傳分化，可能導(dǎo)致序