化妝品中補(bǔ)骨脂特征成分補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、新補(bǔ)骨脂異黃酮和補(bǔ)骨脂二氫黃酮的檢測方法

PAGE附件17：化妝品中補(bǔ)骨脂特征成分補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、新補(bǔ)骨脂異黃酮和補(bǔ)骨脂二氫黃酮的檢測方法1適用范圍本方法規(guī)定了用高效液相色譜法定性檢測化妝品中補(bǔ)骨脂特征成分補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、新補(bǔ)骨脂異黃酮和補(bǔ)骨脂二氫黃酮的方法。本方法適用于化妝品中補(bǔ)骨脂特征成分補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、新補(bǔ)骨脂異黃酮和補(bǔ)骨脂二氫黃酮的定性測定。2方法提要樣品在經(jīng)過提取后，經(jīng)高效液相色譜儀分離，二極管陣列檢測器檢測，經(jīng)與平行操作的補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、新補(bǔ)骨脂異黃酮和補(bǔ)骨脂二氫黃酮對照品及補(bǔ)骨脂對照藥材比較，以保留時間和紫外光譜圖定性，鑒別補(bǔ)骨脂特征成分補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、新補(bǔ)骨脂異黃酮和補(bǔ)骨脂二氫黃酮的存在。本方法對補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、新補(bǔ)骨脂異黃酮和補(bǔ)骨脂二氫黃酮的檢出限和取樣品0.5g時的檢出濃度見表1。表14種補(bǔ)骨脂特征成分的檢出限和檢出濃度化合物檢出限（ng）檢出濃度（μg/g）補(bǔ)骨脂素0.30.6異補(bǔ)骨脂素0.30.6新補(bǔ)骨脂異黃酮0.30.6補(bǔ)骨脂二氫黃酮0.30.63試劑和材料除另有規(guī)定外，所用試劑均為分析純，水為實(shí)驗(yàn)室用一級水。3.1乙腈，色譜純。3.2補(bǔ)骨脂素，純度≥99%。3.3異補(bǔ)骨脂素，純度≥99%。3.4新補(bǔ)骨脂異黃酮，純度≥98%。3.5補(bǔ)骨脂二氫黃酮，純度≥99%。3.6補(bǔ)骨脂，中國食品藥品檢定研究院，供鑒別用。3.7補(bǔ)骨脂特征性成分混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（=0.1μg/mL）：分別稱取補(bǔ)骨脂素（3.2）、異補(bǔ)骨脂素（3.3）、新補(bǔ)骨脂異黃酮（3.4）、補(bǔ)骨脂二氫黃酮（3.5）對照品各5mg（精確到0.1mg），置500mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成質(zhì)量濃度各為10μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密量取各標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1mL置10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得0.1μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。3.8補(bǔ)骨脂標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：取補(bǔ)骨脂對照藥材0.2g，置50mL三角瓶中，加30mL70%乙醇回流提取1h，濾過，濾液置100mL量瓶中，加70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得。4儀器4.1高效液相色譜儀：具二極管陣列檢測器。4.2分析天平：感量為0.1mg。4.3移液器。4.4渦旋振蕩器。4.5超聲波清洗儀（功率不低于200W）。4.6高速離心機(jī)：轉(zhuǎn)速不小于10000r/min。5測定步驟5.1樣品預(yù)處理膏、霜、乳類：稱取0.5g（精確至0.1mg）樣品，置10mL量瓶中，加6mL甲醇，渦旋振蕩使試樣與提取溶劑充分混勻，超聲提取20min，放至室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，轉(zhuǎn)移至10mL具塞塑料離心管中，以12000r/min離心5min，上清液經(jīng)0.45μm濾膜過濾，濾液作為待測溶液備用。液體類：稱取0.5g（精確至0.1mg）樣品，置10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，混勻，必要時，轉(zhuǎn)移至10mL具塞塑料離心管中，以12000r/min離心5min，上清液經(jīng)0.45μm濾膜過濾，濾液作為待測溶液備用。固體粉類：稱取0.5g（精確至0.1mg）樣品，置10mL量瓶中，加8mL甲醇，混勻，超聲提取20min，放至室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，靜置，必要時，轉(zhuǎn)移至10mL具塞塑料離心管中，以12000r/min離心5min，上清液經(jīng)0.45μm濾膜過濾，濾液作為待測溶液備用。5.2高效液相色譜參考條件色譜柱：C18柱（100mm×4.6mm，3μm，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑）或具有同等柱效的色譜柱；流動相：乙腈＋0.1%醋酸水溶液，梯度洗脫，洗脫程序見表1。表1流動相乙腈和酸水梯度洗脫程序（體積比）時間/min0212131516乙腈＋0.1%醋酸水溶液40＋6040＋6070＋3090＋1090＋1040＋60注：梯度洗脫條件，操作者可根據(jù)樣品的不同選擇最佳條件，使4種成分與其他組分峰獲得完全分離。流速：1.0mL/min。檢測波長：246nm。柱溫：30℃。進(jìn)樣量：10μL。5.3樣品測定按設(shè)定的色譜條件（5.2），取補(bǔ)骨脂特征性成分混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（3.7）進(jìn)樣，進(jìn)行高效液相色譜分析，記錄各色譜峰相應(yīng)的保留時間和紫外光譜圖；取補(bǔ)骨脂標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（3.8）進(jìn)行高效液相色譜分析，記錄各色譜峰相應(yīng)的保留時間和紫外光譜圖。取待測溶液（5.1）進(jìn)樣10μL分析，若樣品色譜圖中，在與補(bǔ)骨脂特征性成分--補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、新補(bǔ)骨脂異黃酮和補(bǔ)骨脂二氫黃酮對照品相應(yīng)保留時間處有相同色譜峰出現(xiàn)，且具有相同的紫外光譜，則可以定性鑒別補(bǔ)骨脂特征性成分補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、新補(bǔ)骨脂異黃酮和補(bǔ)骨脂二氫黃酮的存在。5.4平行試驗(yàn)按以上步驟操作，對同一樣品獨(dú)立進(jìn)行測定，獲得的兩次獨(dú)立測試的色譜峰保留時間不得超過±1min。5.5陽性結(jié)果確證測定過程中若補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素檢出陽性結(jié)果，而新補(bǔ)骨脂異黃酮和補(bǔ)骨脂二氫黃酮低于檢出限，可適當(dāng)富集樣品對新補(bǔ)骨脂異黃酮和補(bǔ)骨脂二氫黃酮的檢測進(jìn)一步確證。6精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性高、低兩個濃度水平的補(bǔ)骨脂標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液的精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性，在不同空白基質(zhì)中，補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素、新補(bǔ)骨脂異黃酮和補(bǔ)骨脂二氫黃酮4種特征性成分的保留時間和峰面積的RSD均小于5%（n=6）。7色譜圖31423