漢恒生物無(wú)縫克隆引物快速設(shè)計(jì)教程

漢恒生物基于GibsonAssembly的無(wú)縫克隆快速設(shè)計(jì)教程軟件：GenomeCompiler設(shè)計(jì)舉例：把LacZ克隆到pEGFP-N3中，得pLacZ-EGFP難點(diǎn)：LacZ需要和EGFP融合表達(dá)，所以克隆位點(diǎn)的選擇尤其關(guān)鍵！注：Snapgene也可以設(shè)計(jì)，容后開(kāi)篇介紹。下載pEGFP-N3的載體文件。我們推薦從Snapgen網(wǎng)站下載。導(dǎo)入到Genomecompiler中〔如圖1〕。LacZ序列軟件本身就有，可以搜索得到。圖1點(diǎn)擊File-newconstructionproject,再點(diǎn)擊下面的GibsonAssembly進(jìn)入〔圖2〕。圖2把BackbonepEGFP-N3拖入，載體信息會(huì)完全展示出來(lái)，包括序列、圖譜和各種注釋〔圖3-4〕。點(diǎn)擊sequence和circular可以在質(zhì)粒的序列和圖譜之間切換，方便查看。圖4所示的是我們選中對(duì)多克隆位點(diǎn)MCS的序列展示。圖3圖4圖4之間有一些選項(xiàng)：快速克隆首先需要對(duì)載體進(jìn)行線性化處理。通常有2種方法：雙酶切線性化和PCR線性化。本次教程我們來(lái)講雙酶切線性化。本例是做融合蛋白的克隆構(gòu)建，所以必須考慮讀碼框的問(wèn)題。簡(jiǎn)而言之，就是要融合表達(dá)的兩個(gè)蛋白之間間隔的堿基數(shù)必需是3的倍數(shù)，比方9bp，15bp，21bp這樣子，而且不能含有終止密碼子StopCodon-TAA，TAG和TGA。鑒于此，我們選擇雙酶切的時(shí)候一定要足夠小心，確保滿足第6條的標(biāo)準(zhǔn)。比方在本例中我們選擇NheI和BamHI(如圖5)，BamHI識(shí)別序列為GGATCC6堿基限制性內(nèi)切酶，編碼兩個(gè)氨基酸G和S，因此，可以作為讀碼框的一局部。而B(niǎo)amHI識(shí)別位點(diǎn)GGATCC距離下游GFP的舉例為15bp，剛好包含5個(gè)氨基酸GSIAT〔如圖15〕。如果不能完美對(duì)框，比方距離為14bp，那么需要在引物合成的時(shí)候補(bǔ)上1個(gè)〔非終止密碼子〕堿基，如果是13bp，那么需要補(bǔ)2個(gè)〔非終止密碼子〕堿基等。圖5然后我們選中NheI，會(huì)自動(dòng)出來(lái)下面的選項(xiàng)，酶切位點(diǎn)的處理方式，包括不處理Nonprocessed〔不處理〕，regenerate〔再生〕和Eliminate〔去除〕。我們選擇regenerate〔再生〕，這樣保證構(gòu)建的克隆酶切位點(diǎn)可以恢復(fù)〔圖6〕。同樣的，下游的酶切位點(diǎn)也同樣處理。然后點(diǎn)擊下一步。圖6這一步是選擇insert〔插入片段〕。我們選擇”Addfragment“〔圖7〕。把LacZ文件拖進(jìn)去〔圖8〕.中間可以對(duì)插入片段重命名，位置也可以自由定制〔本例中選擇的時(shí)候注意不要帶StopCodon〕。本例LacZ序列不帶stopcondon，我們選擇selectall即可。如果是做多片段組裝，方法同上。需要對(duì)齊讀碼框的請(qǐng)一定格外小心。點(diǎn)擊下一步。圖7圖8這一步就進(jìn)入引物設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)階段。默認(rèn)重疊序列15-25bp，TM值在50度〔圖9〕。點(diǎn)擊runassembly。引物序列就設(shè)計(jì)好了〔圖10〕.但我們不著急，繼續(xù)下一步。圖9圖10下一步就把克隆虛擬組裝好了〔圖11〕。但我們一定要check一下讀碼框是否和我們預(yù)想的一樣正確。我們選中LacZ-EGFP序列。然后選中Annotationlayers，點(diǎn)擊ORF旁邊的小齒輪進(jìn)入設(shè)置〔圖12，13〕。因?yàn)檫@個(gè)融合讀碼框很大〔超多600個(gè)氨基酸〕，我們范圍也選定到大于600aa。點(diǎn)擊確認(rèn)〔圖14〕。圖11圖12圖13圖14圖14圖譜中會(huì)出現(xiàn)一個(gè)環(huán)形箭頭，代表一個(gè)ORF。我們切換到序列，找到LacZ和EGFP的融合出看看細(xì)節(jié)〔圖15〕。箭頭分別指示了3個(gè)ORF—LacZ，EGFP和LacZ-EGFP融合，發(fā)現(xiàn)融合以后兩者的讀碼框嚴(yán)格保存，而中間就多了GSIAT5個(gè)氨基酸。說(shuō)明和我們預(yù)想的一致，設(shè)計(jì)ok。點(diǎn)擊完成即可。圖15完了保存。引物會(huì)在圖譜里面顯示出來(lái)。切換到線性圖譜模式，選中引物，右鍵選擇“cop