備課素材：PCR引物設(shè)計(jì)的原則-2023-2024學(xué)年高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修3

PCR引物設(shè)計(jì)的原則PCR引物是人工合成的一段寡聚核苷酸。PCR中通常需要兩種引物。一種與感興趣區(qū)域一端的一條DNA模板鏈互補(bǔ)，另—種與感興趣區(qū)域另一端的另一條DNA模板鏈互補(bǔ)。PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，因此，PCR的首要任務(wù)就是引物設(shè)計(jì)。引物設(shè)計(jì)的好壞，直接影響了PCR的結(jié)果。成功的PCR反應(yīng)既要高效，又要特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。引物設(shè)計(jì)的目的是在兩個(gè)目標(biāo)間取得平衡：擴(kuò)增特異性和高效性。因此，引物的設(shè)計(jì)需要把握以下原則：①引物長(zhǎng)度要適宜一般，引物的長(zhǎng)度為15-23bp，常用的長(zhǎng)度為18-21bp。過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq

酶進(jìn)行反應(yīng)。過(guò)短則特異性差。②引物GC含量要適宜a.引物3'端的堿基一般不用A，因?yàn)锳在錯(cuò)誤引發(fā)位點(diǎn)的引發(fā)效率相對(duì)比較高，而其它三種堿基的錯(cuò)誤引發(fā)效率相對(duì)小一些。

b.3'端防止連續(xù)三個(gè)C或G，引物的GC含量一般為45-55%，過(guò)高或過(guò)低都不利于引發(fā)反應(yīng)。c.上下游引物的GC含量不能相差太大。③引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列堿基要隨機(jī)分布，且引物自身和引物之間不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。否則引物自身會(huì)折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)或二聚體，從而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。④引物5'端可以修飾，3'端不可修飾a.引物的5'

端決定著PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度，它對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性。引物5'端修飾包括：加酶切位點(diǎn)，加標(biāo)記熒光，引入點(diǎn)突變、插入突變、缺失突變序列；引入啟動(dòng)子序列等。b.引物的延伸是從3'端開(kāi)始的，不能進(jìn)行任何修飾。c.在引物的5`端連接一對(duì)限制酶的識(shí)別序列，這樣便于目的基因連接到載體上。引物5`端鏈接限制酶的識(shí)別序列（兩種引物兩種限制酶）雙酶切優(yōu)點(diǎn)：防止自連⑤退火溫度要適宜退火溫度高，擴(kuò)增特異性強(qiáng)；退火溫度低，擴(kuò)增效率高。原因：如果引物堿基數(shù)較少，可以適當(dāng)提高退火溫度，這樣可以使PCR的特異性增加；如果堿基數(shù)較多，那么可以適當(dāng)減低退火溫度，使DNA雙鏈結(jié)合。一對(duì)引物的退火溫度相差4℃～6℃不會(huì)影響PCR的產(chǎn)率，但是理想情況下一對(duì)引物的退火溫度是一樣的。例1．科研人員將目的基因J與質(zhì)粒構(gòu)建重組表達(dá)載體，該質(zhì)粒的部分結(jié)構(gòu)如圖所示，下列敘述錯(cuò)誤的是（

）A．除圖中標(biāo)出的結(jié)構(gòu)外，質(zhì)粒還需具備的結(jié)構(gòu)有復(fù)制原點(diǎn)、標(biāo)記基因、限制酶切位點(diǎn)等B．與圖中啟動(dòng)子結(jié)合的酶是RNA聚合酶C．用PCR檢測(cè)J基因連接到質(zhì)粒中且方向正確可選用的一對(duì)引物是F1和R2D．若J基因轉(zhuǎn)錄的鏈位于b鏈，可知引物F1與基因J的b鏈相應(yīng)部分序列相同解析：A、圖中有啟動(dòng)子和終止子等，因此質(zhì)粒還需具備的結(jié)構(gòu)有限制酶的切割位點(diǎn)、標(biāo)記基因、復(fù)制原點(diǎn)等，A正確；B、啟動(dòng)子是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，B正確；C、引物F2與R1或F1與R2結(jié)合部位包含J基因的堿基序列，因此推測(cè)為了確定J基因連接到質(zhì)粒中且插入方向正確，進(jìn)行PCR檢測(cè)時(shí)，若僅用一對(duì)引物，應(yīng)選擇圖甲中的引物F2和R1或F1與R2，C正確；D、b是模板鏈，而根據(jù)圖上啟動(dòng)子和終止子的位置可知轉(zhuǎn)錄方向是圖上從左向右，對(duì)應(yīng)的模板鏈方向應(yīng)該是3’-5'，非模板鏈（也就是a鏈）是5'-3'；考慮到DNA復(fù)制的方向是子鏈的5’-3'，引物基礎(chǔ)上延伸的方向肯定是5'-3'，所以引物結(jié)合的單鏈其方向是3'-5'；圖中F1是前引物，在左側(cè)，所以其配對(duì)的單鏈?zhǔn)?’-5'的b鏈，故其序列應(yīng)該與a鏈相應(yīng)部分的序列相同，D錯(cuò)誤。故選D。2.通過(guò)引物設(shè)計(jì)運(yùn)用PCR技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)目的基因的定點(diǎn)突變?nèi)鐖D為基因工程中獲取突變基因的過(guò)程，其中引物1序列中含有一個(gè)堿基T不能與目的基因片段配對(duì)，但不影響引物與模板鏈的整體配對(duì)，反應(yīng)體系中引物1和引物2的5'端分別設(shè)計(jì)增加限制性內(nèi)切酶a和限制性內(nèi)切酶b的識(shí)別位點(diǎn)。有關(guān)敘述不正確的是（

）A．兩種引物中設(shè)計(jì)兩種限制酶識(shí)別位點(diǎn)有利于目的基因的定向插入B．一個(gè)DNA分子在第2輪PCR后，得到的四個(gè)DNA分子各不相同C．第2輪PCR，引物1與圖中②結(jié)合并且形成兩條鏈等長(zhǎng)的突變基因D．在第3輪PCR結(jié)束后，含突變堿基對(duì)且兩條鏈等長(zhǎng)的DNA占1/4解析：A、引物中設(shè)計(jì)兩種限制酶識(shí)別位點(diǎn)，可以配合載體的限制酶識(shí)別位點(diǎn)，幫助目的基因定向定點(diǎn)插入運(yùn)載體，避免發(fā)生自身環(huán)化，A正確；B、第一、二輪循環(huán)合成的子鏈長(zhǎng)度均不同，根據(jù)半保留復(fù)制特點(diǎn)可知，前兩輪循環(huán)產(chǎn)生的四個(gè)DNA分子的兩條鏈均不等長(zhǎng)，一個(gè)DNA分子在第2輪PCR后，得到的四個(gè)DNA分子各不相同，B正確；C、在第3輪PCR中，物質(zhì)②是引物2以引物1拓展得到的DNA鏈為模板進(jìn)行復(fù)制得到的，故引物1能與圖中②結(jié)合并且形成兩條鏈等長(zhǎng)的突變基因，C錯(cuò)誤；D、在第3輪PCR結(jié)束后，含突變堿基對(duì)且兩條鏈等長(zhǎng)的DNA有2個(gè)，總DNA分子共8個(gè)，所以比例為1/4，D正確。故選C。3.編碼基因的特異性定點(diǎn)突變可通過(guò)PCR方法替換個(gè)別核苷酸獲得突變基因。在PCR法中共設(shè)計(jì)有4條引物，其中一組引物用來(lái)引入特定的突變（引物2和3，個(gè)別核苷酸差異不影響引物與模板鏈的結(jié)合）。首先，為防止引物相互雜交，需要設(shè)計(jì)兩個(gè)反應(yīng)體系，分別加入引物對(duì)

、

用于合成PCR產(chǎn)物1和PCR產(chǎn)物2；然后，將PCR產(chǎn)物1和2加入無(wú)引物的PCR反應(yīng)體系得到含有定點(diǎn)突變的目的基因，再用引物1+引物4擴(kuò)增目的基因得到大量的點(diǎn)突變目的基因。為了使擴(kuò)增的目的基因兩側(cè)能被某種限制酶酶切形成黏性末端，對(duì)引物1和引物4的要求是。解析：據(jù)圖PCR產(chǎn)物1和PCR產(chǎn)物2的位置分析可知道，為了防止引物相互雜交，需要設(shè)計(jì)兩個(gè)反應(yīng)體系，分別加入引物對(duì)為1+2和3+4；因?yàn)槟康幕騼蓚?cè)沒(méi)有某種限制酶的酶切位點(diǎn)，所以為了使擴(kuò)增的目的基因兩側(cè)能被某種限制酶酶切形成黏性末端，應(yīng)該在引物1和4均帶上該限制酶識(shí)別序列。4.下圖為目的基因部分序列：

應(yīng)選擇的一對(duì)引物是：

A．5’-ATGACAGTTAGT-3’

B．5’-TACTGCCGGTGA-3’C．5’-TCACCGGCAGTA-3’

D．5’-ACTAACTGTCAT-3’

如上圖所示，構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)為避免反向拼接應(yīng)選擇

識(shí)別切割質(zhì)粒，再用

連接。已知目的基因上無(wú)相關(guān)酶切位點(diǎn)，應(yīng)在引物的

（填“5’”或“3’”）端設(shè)計(jì)酶切序列，目的基因上游設(shè)計(jì)的酶切序列+引物序列為5’-

-3’。已知DUR1，2基因的轉(zhuǎn)錄模板鏈為A鏈，若DUR1，2基因反向連接，構(gòu)建出反義DUR1，2基因，則其轉(zhuǎn)錄模板鏈為

鏈。造成的結(jié)果是轉(zhuǎn)反義DUR1，2基因酵母工程菌中內(nèi)源的DUR1，2基因表達(dá)受阻，原因可能是

。解析：PCR過(guò)程需要兩種引物，能分別與目的基因兩條鏈的3'端通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，AC正確，BD錯(cuò)誤。故選AC。由圖可知，在強(qiáng)啟動(dòng)子和終止子中間含有限制酶EcoRI和BamHI的識(shí)別位點(diǎn)，因此構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)為避免反向拼接應(yīng)選擇EcoRI和BamHI識(shí)別切割質(zhì)粒，再用DNA連接酶進(jìn)行連接。引物使DNA聚合酶能夠從引物的3'端開(kāi)始連接脫氧核苷酸，故應(yīng)在引物的5’端設(shè)計(jì)酶切序列，擴(kuò)增目的基因時(shí)其右邊需要添加EcoRI識(shí)別序列5'-GAATTC-3'，且引物需要與模板鏈堿基序列3'端進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)，故