實(shí)驗(yàn)室做細(xì)胞常用染色

實(shí)驗(yàn)室做細(xì)胞常用的細(xì)胞固定與染色方法一、爬片前蓋玻片處理方法對(duì)于懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞，在進(jìn)行各種染色前常需先制備成涂片。為了保證細(xì)胞在長(zhǎng)時(shí)間的染色過程中不從載玻片脫落，必須使其牢固貼附于載玻片上。在載玻片上涂布一層有助于細(xì)胞黏附的物質(zhì)是經(jīng)常采用的方法之一。能促進(jìn)細(xì)胞黏附的物質(zhì)主要有多聚賴氨酸、鉻礬明膠等，這里介紹多聚賴氨酸的涂布方法。1、將載玻片用玻璃專用洗滌劑(如Decon)浸泡5min，間或振蕩。2、用自來水沖洗5min。3、以1％鹽酸—70％乙醇溶液浸泡5min。4、烤箱干燥(至此即可用于普通染色)。5、多聚L-賴氨酸(1:10溶于去離子水)浸泡5min，振蕩。6、入60℃烤箱1h，或室溫過夜干燥(用于細(xì)胞化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)及原位雜交細(xì)胞化學(xué))。二、細(xì)胞固定常用方法固定細(xì)胞的目的在于把組織和細(xì)胞的原有結(jié)構(gòu)盡可能完整地保存下來，避免組織和細(xì)胞發(fā)生降解、自溶、腐敗和變形等，使細(xì)胞和組織內(nèi)的各種酶失去活性，防止細(xì)胞和組織的各種分子變性、解離，使細(xì)胞的化學(xué)物質(zhì)和酶能準(zhǔn)確定位，并在以后的處理和制片過程中亦不發(fā)生改變和破壞。同時(shí)，固定還可使細(xì)胞的各部分易于著色，適于觀察、長(zhǎng)期保存和分析。1.固定組織、細(xì)胞的基本原則：盡可能選用新鮮培養(yǎng)物；根據(jù)檢測(cè)工具、對(duì)象、目的和要求選擇固定劑和固定方法。2.培養(yǎng)物的準(zhǔn)備和固定前處理：各種細(xì)胞培養(yǎng)物，如雙蓋片懸滴培養(yǎng)物、懸液培養(yǎng)物、單層培養(yǎng)物和蓋片單層培養(yǎng)物都可作固定材料。對(duì)雙蓋片懸滴培養(yǎng)物和懸液培養(yǎng)物來說，常通過離心收集細(xì)胞，PBS漂洗2～3次后，備固定制片；對(duì)蓋片單層培養(yǎng)物來說，將蓋片從培養(yǎng)器皿中取出后，PBS液漂洗2～3次，以洗去血清和附著于細(xì)胞表面的殘?jiān)瑐涔潭ㄓ谩?.常用固定液：常用的固定液分兩類，一類是以單一化學(xué)物質(zhì)配成的固定液，稱簡(jiǎn)單固定液。主要有甲醇、乙醇、甲醛、醋酸、丙酮、戊二醛、苦味酸、鉻酸、重鉻酸鉀、氯化汞、氯化鎘、四氧化鋨(鋨酸)。另一類是用兩種或兩種以上化學(xué)物質(zhì)配合成的固定液，稱混合固定液。如Mueller固定液、Flemming固液、FAA固定液、

Carnoy固定液、Rossman固定液、Altmann固定液、Bouing固定液等。不同的固定液對(duì)細(xì)胞的化學(xué)成分、酶類及細(xì)胞結(jié)構(gòu)固定效果不同。因此，選擇合適的固定液是達(dá)到固定目的的基礎(chǔ)。(1)4％甲醛-PBS:甲醛是一種氣體，其飽和水溶液無色，約含40％甲醛。在很多情況下，甲醛常常產(chǎn)生多聚甲醛的白色沉淀。4％甲醛-PBS使組織變硬速度比乙醇快，并能較好地保存組織的外部形式，固定效果不受制片影響，固定材料可用蘇木精和其他合成染料染色。甲醛的穿透力較強(qiáng)，對(duì)組織固定均勻，能增強(qiáng)組織的彈性，大標(biāo)本的固定和保存多用甲醛。甲醛是染色體、線粒體和高爾基體的固定液，在冷凍切片中，甲醛作固定劑具有顯著的優(yōu)點(diǎn)。用40％甲醛水溶液:PBS=1:9配方制備甲醛固定液。(2)丙酮：丙酮為無色易揮發(fā)液體，用純冷丙酮(4℃)固定細(xì)胞內(nèi)酶效果較佳。銨礬或鉀礬，0.1g碘酸鈉加溫溶于70m1蒸餾水。再加入30ml甘油，

2ml冰醋酸。混勻。過濾后即成母液?？砷L(zhǎng)久保存。用蒸餾水以1:20稀釋即成工作液，可用很長(zhǎng)時(shí)間。每次染色前宜過濾，去除氧化膜。(2)伊紅染液：伊紅有醇溶性與水溶性之分。將0.5g伊紅溶于100m170％乙醇或蒸餾水即成工作液。1.1.2染色程序（1）用10％甲醛(福爾馬林)固定培養(yǎng)物30min，或以丙酮固定15min。（2）蒸餾水洗1次后，入蘇木精染液5～10min染細(xì)胞核。（3）入0.5％鹽酸-70％乙醇溶液30～1min，脫去胞質(zhì)的著色。此時(shí)核呈紫紅色。（4）入堿性溶液堿化，使細(xì)胞核變成藍(lán)色。如果時(shí)間允許，最好用自來水(呈弱堿性)長(zhǎng)時(shí)間浸泡。也可入1％NaHCO3溶液。此過程須不斷用顯微鏡監(jiān)視，以掌握堿化時(shí)間。（5）蒸餾水洗1min，去除殘留的堿性溶液，否則影響伊紅著色。（6）入伊紅染液30s～1min。（7）用梯度乙醇溶液脫水：70％、90％、95％乙醇各30s～1min；100％(2次)各2min。如伊紅為乙醇溶液，略去70％乙醇。（8）用二甲苯透明2次，各5min。（9）樹膠封固。1.1.3染色結(jié)果細(xì)胞核呈紫藍(lán)色或深藍(lán)色，大部分細(xì)胞的胞質(zhì)呈粉紅色。如果胞質(zhì)內(nèi)含較多核糖體(例如淋巴細(xì)胞)則亦呈藍(lán)色。1.2吉姆薩染色法此法可將細(xì)胞核與胞質(zhì)同時(shí)染色，故便捷快速；但染液配制技術(shù)不易準(zhǔn)確掌握，效果常不如HE染色穩(wěn)定。1.2.1吉姆薩(Giemsa)染液的配制（1）取1.5g吉姆薩粉末放入50ml甘油，置于60℃溫箱，約3h后溶解。（2）取出后倒入50ml中性甲醇，即為母液。于棕色瓶可長(zhǎng)久保存。需要注意的是，有的甲醇內(nèi)含醋酸，會(huì)使染液中的伊紅沉淀出來，不利染色。（3）將母液與0.1mol／LPBS(Ph6.9～7.2)按1:9混合即成工作液。吉姆薩染液對(duì)pH極敏感，偏酸時(shí)染色過紅，偏堿時(shí)則過藍(lán)。所以，工作液宜現(xiàn)用現(xiàn)配，保存時(shí)間不超過48h以免被CO2酸化。1.2.2染色程序（