GB∕T 43169-2023 馬鈴薯斑紋病菌檢疫鑒定方法（正式版）

馬鈴薯斑紋病菌檢疫鑒定方法2023-09-07發(fā)布國家市場監(jiān)督管理總局I本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草原則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由全國植物檢疫標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(SAC/TC271)提出并歸口。本文件起草單位：中國檢驗檢疫科學(xué)研究院、廣州海關(guān)技術(shù)中心、上海海關(guān)動植物與食品檢驗檢疫技術(shù)中心、滿洲里海關(guān)技術(shù)中心、中華人民共和國銀川海關(guān)。1馬鈴薯斑紋病菌檢疫鑒定方法1范圍本文件描述了馬鈴薯斑紋病菌的檢疫鑒定方法。本文件適用于茄科和傘形科等植物的種子、種苗、塊莖、塊根等植物材料以及傳播介體木虱中馬鈴薯斑紋病菌的檢疫鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成文本必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法3術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4馬鈴薯斑紋病菌基本信息中文名稱：馬鈴薯斑紋病菌分類地位：原核生物界(KingdomMonera),變形菌門(Proteobacteria),a-變形菌綱(Alphapro-韌皮部桿菌屬(CandidatusLiberibacter)。馬鈴薯斑紋病菌其他信息見附錄A。5方法原理馬鈴薯斑紋病菌目前還無法培養(yǎng)，因此方法原理為采用馬鈴薯斑紋病菌特異性引物或探針，通過普通聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction,PCR)、巢式PCR或?qū)崟r熒光PCR方法進(jìn)行檢測。6儀器設(shè)備和主要試劑6.1儀器設(shè)備支持寡核苷酸探針(TaqMan)雙標(biāo)記水解探針，溫度控制范圍為30℃~100℃。2溫度控制范圍為4℃~99℃。波長為230nm～260nm。潔凈等級100級，過濾效率達(dá)到99.99%。電壓10V～300V,最小可調(diào)1V;電流4mA～400mA,最小可調(diào)1mA。紫外透射波長為302nm。轉(zhuǎn)速為50r/min～600r/min。轉(zhuǎn)速≥12000r/min。轉(zhuǎn)速為200r/min～3000r/min。精確度為0.001g。溫度控制范圍為室溫至100℃。制備出的純水水質(zhì)應(yīng)符合GB/T6682中一級水的規(guī)格。最高工作溫度不低于121℃。乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)、PCR緩沖液、脫氧核糖核苷酸三磷酸(dNTPs)、脫氧核糖核酸(de-3oxyribonucleicacid,DNA)聚合酶、引物和探針、瓊脂糖、三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇、雙重去離子水(doubledistilledwater,ddH?O)。7病菌的鑒定7.1癥狀檢查該病菌在不同寄主甚至同一寄主不同品種上的為害癥狀及為害程度均有差異。馬鈴薯、番茄可檢管束組織變褐、內(nèi)部組織產(chǎn)生髓質(zhì)射線，該癥狀通常在塊莖切片或切塊油炸后表現(xiàn)較為明顯，即薯片或薯條出現(xiàn)黑斑或斑紋。胡蘿卜、芹菜可檢查植株地上和地下部分，地上部分的癥狀表現(xiàn)為葉片卷曲黃化、葉片增生；地下部分癥狀表現(xiàn)為根變形、發(fā)育不良以及次生根增殖。具體癥狀圖片見附錄B。7.2樣品采集與制備7.2.1植株樣品制備采集樣品時要同時采集有癥狀和無癥狀的葉片和/或莖，從有癥狀的植物上取3片～5片植物葉片和/或莖，無癥狀植物上不同部位取5片～10片葉子(包括新生葉片)和/或莖。植物地下部分如馬鈴薯塊莖，胡蘿卜根等都能夠用來檢測馬鈴薯斑紋病菌，選取癥狀明顯的組織進(jìn)行檢測。在進(jìn)行提取之莖維管束環(huán)。植物樣品用研磨儀或液氮進(jìn)行研磨處理。種子樣品可任選以下兩種方法之一進(jìn)行制備處理：——取種子樣品1g～2g(例如：胡蘿卜種子約450?！?00粒)直接用研缽研磨，或用研磨機(jī)研磨，或置塑料袋內(nèi)用錘子粉碎后，取適量粉碎樣品提取核酸；——取種子樣品1g～2g(例如：胡蘿卜種子約450?！?00粒)加入50mL～100mLPBS緩沖液4℃冰箱浸泡過夜，棄緩沖液，浸泡后的種子用研磨儀研磨，研磨后加20mLPBS緩沖液振蕩混勻，然后用紗布或濾紙過濾，濾液12000r/min離心后取沉淀物提取核酸。另外，如果是種衣劑處理過的種子應(yīng)先去除種衣，按照每克種子加入10mL～50mL0.5%TritonX-100的比例振蕩洗滌30min,洗3次后在水中過夜軟化，再任選上述兩種方法之一進(jìn)行制備處理。7.2.3木虱樣品制備從有癥狀或無癥狀的植物中收集成蟲木虱，置于研缽中加入液氮研磨備用。7.3核酸提取根據(jù)常規(guī)的十六烷基三甲基溴化銨法(Cetyltrimethylammoniumbromide,CTAB)或商業(yè)化核酸提取試劑盒規(guī)定的質(zhì)量，取植物組織、木虱樣品研磨粉末狀物質(zhì)或種子浸泡液的沉淀物提取待測樣品核酸，且應(yīng)根據(jù)不同提取物(植物、昆蟲)選擇合適的商業(yè)化核酸提取試劑盒。7.4檢測選用普通PCR、巢式PCR、實時熒光PCR檢測方法中的任意一種，檢測具體操作步驟按照附錄C、附錄D和附錄E的規(guī)定。48結(jié)果判定選用普通PCR、巢式PCR、實時熒光PCR檢測方法中任意一種的檢測結(jié)果為陽性，可判定檢出馬鈴薯斑紋病菌。9樣品保存植物組織樣品置于密封樣品袋保存于4℃冰箱中，木虱樣品保存于70%乙醇中，以備復(fù)核。陽性樣品保存期滿后應(yīng)經(jīng)高壓滅菌后方再處理。10結(jié)果記錄與資料保存人和實驗人員的簽字。對檢出馬鈴薯斑紋病菌的樣品應(yīng)保存于4℃冰箱中，以備復(fù)核。普通PCR和巢式PCR瓊脂糖凝膠電泳檢測電泳結(jié)果圖片、熒光PCR檢測原始數(shù)據(jù)等資料應(yīng)妥善保存。5(資料性)馬鈴薯斑紋病菌相關(guān)信息A.1癥狀特征馬鈴薯斑紋病菌危害寄主植物的葉片、枝干、塊莖等部位，在不同寄主上的癥狀存在一定的差異。馬鈴薯、番茄等茄科植物的地上部分的癥狀與植原體的危害癥狀類似，表現(xiàn)為葉片黃化矮化、葉脈地下部分癥狀表現(xiàn)為匍匐莖倒伏、維管束組織變褐、內(nèi)部組織產(chǎn)生髓質(zhì)射線。該癥狀通常在塊莖切片或切塊油炸后表現(xiàn)較為明顯，即薯片或薯條出現(xiàn)黑斑或斑紋。胡蘿卜、芹菜等傘形科植物的地上部分的癥狀與植原體的危害癥狀類似，表現(xiàn)為葉片卷曲黃化、葉片增生；地下部分癥狀表現(xiàn)為根變形、發(fā)育不良以及次生根增殖。A.2寄主范圍馬鈴薯斑紋病菌已知寄主主要有茄科和傘形科植物，茄科包括：馬鈴薯(Solanumtuberosum),番茄(S.lycopersicum),茄子(S.melongena),樹番茄(S.betaceum),銀葉茄(S.elaeagnifolium),東方龍葵(S.ptycanthum),辣椒(Capsicumannuum),煙草(Nicotianatabperuviana),和枸杞(Lyciumbarbarum)等。傘形科包括：胡蘿卜(Daucuscarota),芹菜(Apiumgraveolens),茴香(Foeniculumvulgare),芫荽(Petroselinumcrispum),歐防風(fēng)(Pastinacasativa),香芹(Libanotisseseloides)和歐洲蘿卜(Pastinacasativa)等。蓼科、旋花科和蕁麻科也是其寄主。馬鈴薯斑紋病菌潛在的寄主范圍比已知的寄主范圍更廣泛。A.3分布目前已報道馬鈴薯斑紋病菌分布的國家或地區(qū)如下：利群島；A.4傳播途徑馬鈴薯斑紋病菌可通過帶菌薯塊和種子等繁殖材料進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播；田間通過昆蟲介體傳播。此外，病菌還可通過嫁接、染病植株、帶菌種子和馬鈴薯種薯等進(jìn)行傳播和擴(kuò)散。目前報道的傳播介體包括：馬鈴薯木虱(Bactericeracockerelli)、B.trigonica、B.maculipennis和胡蘿卜木虱(Triozaapicalis)等。A.5單倍型馬鈴薯斑紋病菌目前已知的單倍型有10種(見表A.1),不同單倍型之間具有不同的地理范圍和植物宿主，且與木虱的種類和取食行為密切相關(guān)。6表A.1馬鈴薯斑紋病菌10種單倍型的信息單倍型寄主分布地區(qū)傳播媒介A馬鈴薯、番茄中美洲：洪都拉斯、危地馬拉北美洲：墨西哥、美國(亞利桑那州、加利福尼亞州、俄勒岡州、華盛頓州、愛達(dá)荷州)大洋洲：新西蘭馬鈴薯木虱(Bactericeracock-B馬鈴薯、番茄北美洲：墨西哥、美國馬鈴薯木虱(Bactericeracock-C胡蘿卜、芹菜、茴香、歐洲：芬蘭、瑞典、挪威、德國、奧地利胡蘿卜木虱(Triozaapicalis)D胡蘿卜、芹菜、茴香、亞洲：以色列歐洲：比利時、西班牙、法國、希臘、葡萄牙、非洲：突尼斯、摩洛哥BactericeratrigonicaE馬鈴薯、番茄、胡蘿卜、芹菜、茴香、芫荽等亞洲：以色列、日本歐洲：比利時、西班牙、法國、希臘、葡萄牙、加那利群島非洲：突尼斯、摩洛哥馬鈴薯木虱(Bactericeracock-F馬鈴薯北美洲：美國馬鈴薯木虱(Bactericeracock-G馬鈴薯北美洲：美國馬鈴薯木虱(Bactericeracock-H傘形花科；蓼科歐洲：芬蘭未知旋花科北美洲：美國未知U蕁麻北美洲：墨西哥歐洲：芬蘭、德國蕁麻木虱(Trioeaurticae)7(資料性)馬鈴薯斑紋病菌危害癥狀a)馬鈴薯斑紋病菌危害馬鈴薯葉片的癥狀b)馬鈴薯斑紋病菌危害馬鈴薯葉片的癥狀c)馬鈴薯斑紋病菌危害馬鈴薯塊莖的癥狀d)馬鈴薯斑紋病菌危害馬鈴薯塊莖的癥狀e)馬鈴薯斑紋病菌危害馬鈴薯塊莖切片油炸后的癥狀f)馬鈴薯斑紋病菌危害馬鈴薯塊莖切條油炸后的癥狀圖B.1馬鈴薯斑紋病菌危害馬鈴薯的癥狀8a)馬鈴薯斑紋病菌危害番茄的田間癥狀b)馬鈴薯斑紋病菌危害番茄出現(xiàn)的葉片黃化、卷曲癥狀圖B.2馬鈴薯斑紋病菌危害番茄的癥狀注：左為馬鈴薯斑紋病菌危害胡蘿卜葉片出現(xiàn)卷葉和紫化的癥狀；中為馬鈴薯斑紋病菌危害胡蘿卜葉片僅出現(xiàn)卷葉的癥狀；右為正常的胡蘿卜。a)馬鈴薯斑紋病菌危害芹菜的切面癥狀b)馬鈴薯斑紋病菌危害芹菜出現(xiàn)的葉片增生癥狀9GB/T43169—2023(規(guī)范性)馬鈴薯斑紋病菌普通PCR檢測程序C.1普通PCR擴(kuò)增C.1.1引物序列普通PCR檢測的引物序列見表C.1。表C.1普通PCR檢測的引物序列引物名稱引物序列PCR產(chǎn)物大小/bp上游引物：5'-aattttagcaagttctaaggg-3'下游引物：5'-ggtacctcccatatcgc-3'C.1.2反應(yīng)體系及反應(yīng)條件普通PCR反應(yīng)體系見表C.2。反應(yīng)條件為：94℃3min;94℃30s,55℃30s,72℃40s,40個循環(huán)；72℃5min(當(dāng)使用不同儀器和試劑時，可根據(jù)要求將反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整)。預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物為上述反應(yīng)中均需同時設(shè)置陽性對照(馬鈴薯斑紋病菌)、陰性對照(健康馬鈴薯葉片)和空白對照(以滅菌蒸餾水代替模板DNA)。表C.2反應(yīng)體系組成加樣量10×PCR緩沖液50mmol/L氯化鎂5U/μLTaqDNA聚合酶10ng/μL～100ng/μL模板DNAddH?O補至25注：反應(yīng)體系中各試劑的量使用等效的PCR預(yù)混液時，具體情況根據(jù)采用的試劑進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。C.2瓊脂糖凝膠電泳制備1.5%的瓊脂糖凝膠，按比例均勻電泳上樣緩沖液和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用DNA分子標(biāo)記(Marker)作為分子質(zhì)量標(biāo)記，進(jìn)行電泳分析，電泳結(jié)束后在凝膠成像儀的紫外投射光下觀察是否擴(kuò)增出預(yù)期的特異性DNA條帶，并拍攝記錄。C.3質(zhì)量控制陽性對照應(yīng)出現(xiàn)383bp的預(yù)期擴(kuò)增片段，陰性對照和空白對照應(yīng)都未出現(xiàn)383bp的預(yù)期擴(kuò)增片段。上述指標(biāo)如有一項不符合者，應(yīng)重新進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增。C.4結(jié)果判定檢測樣品如出現(xiàn)383bp的預(yù)期擴(kuò)增片段判為陽性，如未出現(xiàn)383bp的預(yù)期擴(kuò)增片段判為陰性。(規(guī)范性)馬鈴薯斑紋病菌巢式PCR方法D.1巢式PCR擴(kuò)增巢式PCR檢測的引物序列見表D.1。表D.1巢式PCR檢測的引物序列引物名稱引物序列產(chǎn)物大小/bp上游引物：5'-gcgcttatttttaataggagcggca-3'下游引物：5'-gcctcgcgacttegcaacccat-3'Lib16S01F上游引物：5'-ttctacgggataacgcacgg-3'Lib16S01R下游引物：5'-cgtcagtatcaggccagtgag-3'D.1.2反應(yīng)體系及反應(yīng)條件用引物OA2/OI2c進(jìn)行第一輪PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為：94℃5min;94℃30s,58℃30s,72℃(當(dāng)使用不同儀器和試劑時，可根據(jù)要求將反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整)。PCR反應(yīng)體系見表D.2。表D.2第一輪PCR反應(yīng)體系組成加樣量10×PCR緩沖液50mmol/L氯化鎂5U/μLTaqDNA聚合酶10ng/μL～100ng/μL模板DNAddH?O補至25注：反應(yīng)體系中各試劑的量使用等效的PCR預(yù)混液時，具體情況根據(jù)采用的試劑進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。取第一輪PCR產(chǎn)物稀釋10倍后取1μL為模板利用引物L(fēng)ib16S01F/Lib16S01R進(jìn)行第二輪PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為：94℃5min;94℃30s,58℃30s,72℃1min,35個循環(huán)；72℃10min(當(dāng)使用不同儀器和試劑時，可根據(jù)要求將反應(yīng)參數(shù)做適當(dāng)調(diào)整)。PCR反應(yīng)體系見表D.3。表D.3第二輪PCR反應(yīng)體系組成加樣量10×PCR緩沖液50mmol/L氯化鎂5U/μLTaqDNA聚合酶第一輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物ddH?O補至25注：反應(yīng)體系中各試劑的量使用等效的PCR預(yù)混液時，具體情況根據(jù)采用的試劑進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。上述反應(yīng)中均需同時設(shè)置陽性對照(馬鈴薯斑紋病菌)、陰性對照(健康馬鈴薯葉片)和空白對照(以蒸餾水代替模板DNA)。D.2瓊脂糖凝膠電泳制備1.5%的瓊脂糖凝膠，按比例均勻電泳上樣緩沖液和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用DNAMarker作為分子質(zhì)量標(biāo)記，進(jìn)行電泳分析，電泳結(jié)束后在凝膠成像儀的紫外投射光下觀察是否擴(kuò)增出預(yù)期的特異性D.3質(zhì)量控制陽性對照應(yīng)出現(xiàn)580bp的預(yù)期擴(kuò)增片段，陰性對照和空白對照應(yīng)都未出現(xiàn)580bp的預(yù)期擴(kuò)增片段。上述指標(biāo)如有一項不符合者，應(yīng)重新進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增。D.4結(jié)果判定檢測樣品如出現(xiàn)580bp的預(yù)期擴(kuò)增片段判為陽性，如未出現(xiàn)580bp的預(yù)期擴(kuò)增片段判為陰性。(規(guī)范性)馬鈴薯斑紋病菌實時熒光PCR方法E.1實時熒光PCR檢測E.1.1引物及探針序列實時熒光PCR檢測的引物及探針序列見表E.1。表E.1實時熒光PCR檢測的引物及探針序列引物及探針名稱引物及探針序列LsoF上游引物：5'-gtegagcgcttatttttaatagga-3'HLBr下游引物：5'-gcgttatecegtagaaaaaggtag-3'HLBp采針：5'-FAM-agacgggtgagtaacgcg-BHQ-3E.1.2反應(yīng)體系及反應(yīng)條件實時熒光PCR反應(yīng)程序：95℃10min;95℃15s,60℃60s,40個循環(huán)，每個循環(huán)結(jié)束后采集FAM通道熒光信號(當(dāng)使用不同儀器和試劑時，可根據(jù)要求將反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整)。反應(yīng)體系見上述反應(yīng)中均需同時設(shè)置陽性對照(馬鈴薯斑紋病菌)、陰性對照(健康馬鈴薯葉片)和空白對照(以滅菌蒸餾水代替模板DNA)。表E.2反應(yīng)體系組成加樣量2×TaqManreal-timePCRmastermix10ng/μL～100ng/μL模板DNAddH?O補至25注1:在使用具有ROX校正通道的實時熒光PCR儀時按儀器要求添加ROX熒光試劑。注2:反應(yīng)體系中各試劑的量使用等效的PCR預(yù)混液時，具體情況根據(jù)采用的試劑進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。E.2質(zhì)量控制陽性對照循環(huán)數(shù)閾(CycleThreshold,Ct)值≤35,陰性對照和空白對照沒有擴(kuò)增或Ct值>40。上述指標(biāo)如有一項不符合者，應(yīng)重新進(jìn)行實時熒光PCR擴(kuò)增。E.3結(jié)果判定檢測樣品Ct值，若Ct值≤35判為陽性；若在35<Ct值≤40之間，需重復(fù)測試，重復(fù)結(jié)果為典型S形擴(kuò)增曲線，判為陽性，否則判為陰性；檢測樣品無擴(kuò)增或Ct值>40,判為陰性。[1]LiWB,AbadJA,French-MonarR,etal.Multiplexreal-timePCRfordetection,identifi-cationandquantificationof‘CandidatusLiberibactersolanacearum'i