工業(yè)菌種擴大培養(yǎng)技術（微生物育種技術課件）

工業(yè)菌種的擴大培養(yǎng)技術

種子的制備過程

種子擴大培養(yǎng)：將保存在砂土管、冷凍干燥管中處于休眠狀態(tài)的生產菌種接入試管斜面活化后，再經過扁瓶或搖瓶及種子罐逐級擴大培養(yǎng)而獲得一定數量和質量的純種過程。菌種擴大培養(yǎng)的目的：為發(fā)酵提供足夠數量的代謝旺盛的種子（純種培養(yǎng)物）。優(yōu)良種子應具備的條件菌種細胞的生長活力強，移種至發(fā)酵罐后能迅速生長，遲緩期短；生理性狀穩(wěn)定；菌體總量及濃度能滿足大容量發(fā)酵罐的要求；無雜菌污染；保持穩(wěn)定的生產能力。一種子的制備過程種子制備的過程大致可分為：實驗室種子制備階段生產車間種子制備階段制備過程：實驗室：保存菌種→斜面上活化→懸浮液（如為孢子叫孢懸液）→生產車間：一級種子罐→二級種子罐→發(fā)酵罐二、實驗室階段1.細菌菌體的制備細菌的斜面培養(yǎng)基多采用碳源限量而氮源豐富的配方。培養(yǎng)溫度一般為37?C。細菌菌體培養(yǎng)時間一般為1-2天，產芽孢的細菌培養(yǎng)則需要5-10天。放線菌的孢子培養(yǎng)一般采用瓊脂斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含有一些適合產孢子的營養(yǎng)成分，如麩皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些無機鹽等。碳源和氮源不要太豐富（碳源約為1％，氮源不超過0.5％），干燥和限制營養(yǎng)可直接或間接誘導孢子形成。放線菌斜面的培養(yǎng)溫度大多數為28℃，少數為37℃，培養(yǎng)時間為5～14天。（1）放線菌孢子的制備菌種接入種子罐有兩種方法：孢子進罐法——將斜面孢子制成孢子懸浮液直接接入種子罐，可減少批與批之間的差異，具有操作方便、工藝過程簡單、便于控制孢子質量等優(yōu)點；搖瓶菌絲進罐法——適用于某些生長發(fā)育緩慢的放線菌，可以縮短種子在種子罐內的培養(yǎng)時間。菌種母斜面（孢子）搖瓶種子（菌絲）種子罐發(fā)酵罐子斜面（孢子）放線菌發(fā)酵生產的工藝過程：①①制備母斜面孢子、子斜面孢子、搖瓶種子，菌絲接入種子罐②制備母斜面孢子、搖瓶種子，菌絲接入種子罐③制備母斜面孢子、子斜面孢子，孢子接入種子罐④制備母斜面孢子，孢子接入種子罐②③④（2）霉菌孢子的制備霉菌的孢子培養(yǎng)，一般以大米、小米、玉米、麩皮、麥粒等天然農產品為培養(yǎng)基。霉菌的培養(yǎng)一般為25～28℃，培養(yǎng)時間為4～14天。（3）細菌培養(yǎng)物的制備細菌的斜面培養(yǎng)基多采用碳源限量而氮源豐富的配方，牛肉膏、蛋白胨常用作有機氮源。細菌培養(yǎng)基溫度大多數為37℃，少數為28℃，細菌菌體培養(yǎng)時間一般為1～2天，產芽孢的細菌需培養(yǎng)5～10天。三、生產車間種子制備實驗室制備的液體種子移種至種子罐擴大培養(yǎng)。1.種子罐的作用主要是使菌體數量進一步增加，接入發(fā)酵罐能迅速生長，達到一定的菌體量，以利于產物的合成。種子罐的培養(yǎng)基雖因不同菌種而異，但其原則為采用易被菌利用的成分如葡萄糖、玉米漿、磷酸鹽等，如果是需氧菌，同時還需供給足夠的無菌空氣，并不斷攪拌，使菌（絲）體在培養(yǎng)液中均勻分布，獲得相同的培養(yǎng)條件。2.種子罐級數的確定種子罐級數：是指制備種子需逐級擴大培養(yǎng)的次數1．種子罐級數的決定（1）根據生產菌的特性：生產繁殖快慢，如生長繁殖快則級數少（2）根據發(fā)酵罐的接種量：（3）發(fā)酵罐與種子罐的體積比V發(fā)酵罐/V種子罐比數越大，種子級數越大。

發(fā)酵罐接種量少，則級數少，接種量決定于①根據菌的生長特性（生長快接種量少），看接種菌，如細菌接種量1-5%，酵母菌10%，霉菌放線菌7-15%（但霉菌也有少的，如制霉菌素，只用1%）

②根據種子質量：活力高則接種量少現相當多的產品采用大接種量，如慶大霉素發(fā)酵的接種量達20-25%，大接種量優(yōu)點和缺點:優(yōu)點：a.可縮短發(fā)酵罐中菌的生長期，則產物合成的時間可提前，則整個合成時期就增加了，不少種子液中會有水解酶類，有利于發(fā)酵利用。b.可有效地防止發(fā)酵罐的前期染菌，有相當部分的特別是抗生素的生產，種子液中就有抗生素，可利用之抑菌。缺點：a.要求種子罐多b.種子液中含代謝廢物，副產物，在發(fā)酵罐中可能抑制菌的生長和產物的合成。具體接種多少要經過實驗和生產檢驗。細菌：生長快，種子用量比例少，級數也較少，二級發(fā)酵。

搖瓶→種子罐→發(fā)酵罐

細菌：生長快，種子用量比例少，級數也較少，二級發(fā)酵。搖瓶→種子罐→發(fā)酵罐霉菌：生長較慢，如青霉菌，三級發(fā)酵孢子懸浮液→一級種子罐（27℃,40小時孢子發(fā)芽，產生菌絲）→二級種子罐（27℃，10~24小時，菌體迅速繁殖，粗壯菌絲體）→發(fā)酵罐放線菌：生長更慢，采用四級發(fā)酵酵母：比細菌慢，比霉菌，放線菌快，通常用一級種子一般50t發(fā)酵罐多采用三級發(fā)酵，有的也采用四級發(fā)酵如鏈霉素生產；確定種子罐級數需注意的問題種子級數越少越好，可簡化工藝和控制，減少染菌機會種子級數太少，接種量小，發(fā)酵時間延長，降低發(fā)酵罐的生產率，增加染菌機會雖然種子罐級數隨產物的品種及生產規(guī)模而定。但也與所選用工藝條件有關。如改變種子罐的培養(yǎng)條件，加速了孢子發(fā)芽及菌體的繁殖，也可相應地減少種子罐的級數。

用枯草芽孢桿菌生產桿菌肽發(fā)酵時種子擴大培養(yǎng)的程序級數培養(yǎng)條件培養(yǎng)時間1保藏菌種接種到4L搖瓶中18-24h2一級培養(yǎng)物接種到750L發(fā)酵罐中6h3750L培養(yǎng)物接種到6000L發(fā)酵罐中培養(yǎng)到形成最大生物量時46000L培養(yǎng)物接種到12000L生產發(fā)酵罐中培養(yǎng)到形成最大生物量時工業(yè)微生物培養(yǎng)法分為靜置培養(yǎng)和通氣培養(yǎng)兩大類型。靜置培養(yǎng)即將培養(yǎng)基盛于發(fā)酵容器中，在接種后，不通空氣進行培養(yǎng)。通氣培養(yǎng)法的生產菌種以需氧菌和兼性需氧菌居多，它們生長的環(huán)境必須供給空氣，以維持一定的溶解氧水平，使菌體迅速生長和發(fā)酵，又稱好氣培養(yǎng)法。種子培養(yǎng)要求一定量的種子，在適宜的培養(yǎng)基中，控制一定的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)方法，從而保證種子正常生長。四、種子培養(yǎng)表面培養(yǎng)法固體培養(yǎng)法液體深層培養(yǎng)表面培養(yǎng)法是一種靜置培養(yǎng)法。針對容器內培養(yǎng)基物態(tài)又分為液態(tài)表面培養(yǎng)和固體表面培養(yǎng)。相對于容器內培養(yǎng)基體積而言，表面積越大，越易促進氧氣由氣液界面向培養(yǎng)基內傳遞。這種方法菌的生長速度與培養(yǎng)基的深度有關，單位體積的表面積越大，生長速度越快。固體培養(yǎng)又分為淺盤固體培養(yǎng)和深層固體培養(yǎng)，統(tǒng)稱為曲法培養(yǎng)。起源于我國釀造生產特有的傳統(tǒng)制曲技術。最大特點是固體曲的酶活力高。液體深層種子罐從底部通氣，送入的空氣由攪拌槳葉分散成微小氣泡以促進氧的溶解。該法容易按照生產菌種對于代謝的營養(yǎng)要求一級不同生理時期的通氣、攪拌、溫度與培養(yǎng)基中氫離子等條件，選擇最佳培養(yǎng)條件。五、種子質量的控制（二）影響種子質量的因素及控制培養(yǎng)基培養(yǎng)條件種齡接種量（1）營養(yǎng)成分適合種子培養(yǎng)的需要（2）易于被菌體直接吸收和利用；（4）營養(yǎng)成分適當豐富和完全，氮源和維生素含量要高；（5）營養(yǎng)成分要盡可能與發(fā)酵培養(yǎng)基相近。種齡：是指種子罐中培養(yǎng)的菌絲體開始移入下一級種子罐或發(fā)酵罐時的培養(yǎng)時間。通常種齡是以處于生命力極旺盛的對數生長期，菌體量還未達到最大值時的培養(yǎng)時間較為合適。不同菌種或同一菌種工藝條件不同，種齡是不一樣的，一般需經過多種實驗來確定。一般細菌的種齡一般為7～24h，霉菌種齡一般為16～50h，放線菌種齡一般為21～64h。種子培養(yǎng)應選擇最適溫度，培養(yǎng)過程中通氣攪拌的控制很重要。接種量接種量：移入的種子液體積和接種后培養(yǎng)液體積的比例接種量的大小與菌種特性、種子質量和發(fā)酵條件等有關。采用較大的接種量可以縮短發(fā)酵罐中菌絲繁殖達到高峰的時間，使產物的形成提前到來，并可減少雜菌的生長機會。

不同的微生物其發(fā)酵的接種量是不同的：制霉菌素發(fā)酵的接種量為0.1％～1％；肌苷酸發(fā)酵接種量為1.5％～2％；霉菌的發(fā)酵接種量一般為10％；多數抗生素發(fā)酵接種量為7％～15％，有時可加大到20％～25％。（二）種子質量的控制措施種子質量的最終指標是考察其在發(fā)酵罐中所表現出來的生產能力。首先必須保證生產菌種的穩(wěn)定性，其次是提供種子培養(yǎng)的適宜環(huán)境保證無雜菌侵入，以獲得優(yōu)良種子。因此在生產過程中通常進行以下兩項檢查:（1）菌種穩(wěn)定性的檢查（2）無（雜菌）檢查（三）種子質量標準細胞或菌體生化指標產物生成量酶活力菌體形態(tài)可通過顯微鏡觀察來確定。以單細胞菌體為種子的質量要求菌體健壯、菌形一致、均勻整齊，有的還要求有一定的排列和形態(tài)。以霉菌、放線菌為種子的質量要求是菌絲粗壯，對某些染料著色力強、生產旺盛、菌絲分枝情況和內含物情況良好。種子液的糖、氮、磷含量的變化和pH值變化種子應確保無任何雜菌污染。菌種生長緩慢或過快菌絲結團菌絲粘壁（五）種子異常的分析與孢子質量和種子罐的培養(yǎng)條件有關。生產中通入種子罐的無菌空氣溫度較低或培養(yǎng)基的滅菌質量較差。因此生產中培養(yǎng)基滅菌后需取樣測定其pH值，以判斷培養(yǎng)基的滅菌質量。與攪拌效果差、接種量小有關。在種子培養(yǎng)過程中，由于攪拌效果不好，泡沫過多以及種子罐裝料系數過小等原因，使菌絲逐步粘在罐壁上，結果使培養(yǎng)液中菌絲濃度減少，最后就可能形成菌絲團。用梭狀芽孢桿菌進行丁酮丙酮發(fā)酵時種子擴大培養(yǎng)的程序級數培養(yǎng)條件培養(yǎng)基1保藏菌種接種后培養(yǎng)24h馬鈴薯葡萄糖肉湯21級培養(yǎng)物接種到600mL培養(yǎng)基中培養(yǎng)20-24h糖4%，（NH4）2SO45%，CaCO36%，P2O50.2%(以磷酸鹽形式提供)390mL2級培養(yǎng)物接種到含3000mL培養(yǎng)基的4000mL三角瓶中同2級43級培養(yǎng)物接種入25000L發(fā)酵罐中糖6%，其余同2級54級培養(yǎng)物接種入300000-500000L生產發(fā)酵罐中，接種量為0.5%-3%同4級，發(fā)酵過程中補充氨水工業(yè)菌種擴大培養(yǎng)技術

種子質量的控制一、影響種子質量的因素及控制培養(yǎng)基培養(yǎng)條件種齡接種量1.培養(yǎng)基營養(yǎng)成分適合種子培養(yǎng)的需要選擇有利于孢子發(fā)芽和菌體生長的培養(yǎng)基；營養(yǎng)上要易于被菌體直接吸收和利用；營養(yǎng)成分要適當豐富和完全，氮源和維生素含量要高營養(yǎng)成分要盡可能與發(fā)酵培養(yǎng)基相近。2.培養(yǎng)條件（1）溫度（2）通氣量在種子罐中培養(yǎng)的種子除保證供給易被利用的培養(yǎng)基外，有足夠的通氣量可以提高種子質量。3.種齡種齡：是指種子罐中培養(yǎng)的菌絲體開始移入下一級種子罐或發(fā)酵罐時的培養(yǎng)時間。通常種齡是以處于生命力旺盛的對數生長期，菌體量還未達到最大值時的培養(yǎng)時間較為合適。不同菌種或同一菌種工藝條件不同，種齡是不一樣的，一般需經過多種實驗來確定。4.接種量接種量：接入的種子液體積和接種后整個發(fā)酵液體積的比例。二、種子質量的控制措施必須保證生產菌種的穩(wěn)定性提供種子培養(yǎng)的適宜環(huán)境條件，保證無雜菌侵入四.種子質量的控制措施1.

菌種穩(wěn)定性的檢查少量菌種--無菌生理鹽水--遞增稀釋--平板劃線培養(yǎng)。挑出形態(tài)整齊，孢子豐滿的菌落進行搖瓶試驗，測定其生產能力。

2.無菌檢查種子液平板劃線、斜面培養(yǎng)用肉眼觀察是否有異常菌落、異?，F象及鏡檢是否有雜菌。三、種子質量標準1.細胞或菌體單細胞：菌體健壯、菌形一致、均勻整齊有的還要求有一定的排列或形態(tài)2.生化指標

種子液的糖、氮、磷的含量和pH變化。3.產物生成量在抗生素發(fā)酵中，產物生成量是考察種子質量的重要指標，因為種子液中產物生成量的多少間接反映種子的生產能力和成熟程度。4.酶活力種子液中某種酶的活力，與目的產物的產量有一定的關聯。四、種子異常分析

菌種生長速度，過快或過慢菌絲結團菌絲粘壁種子擴大培養(yǎng)舉例例一、谷氨酸生產的種子制備斜面菌種→一級種子培養(yǎng)→二級種子培養(yǎng)→發(fā)酵1、斜面(AS1.299)培養(yǎng)基：蛋白胨1%，牛肉膏1%，氯化鈉0.5

瓊脂2%，pH7.0-7.2培養(yǎng)基特點：有利于菌體的生長，原料比較精細培養(yǎng)條件：32℃，生長18-24小時生長斜面要求：生長良好，所使用斜面連續(xù)傳代不超過3次2.一級種子（搖瓶）培養(yǎng)條件：于1000ml三角瓶中，裝液200-250ml,32℃培養(yǎng)12小時。培養(yǎng)基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米漿2.5%，