GB∕T 43459-2023 潔凈室及受控環(huán)境中細(xì)胞培養(yǎng)操作技術(shù)規(guī)范（正式版）

潔凈室及受控環(huán)境中細(xì)胞培養(yǎng)操作技術(shù)規(guī)范2023-12-28發(fā)布IGB/T43459—2023本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由全國(guó)潔凈室及受控環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(SAC/TC319)提出并歸口。本文件起草單位：中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所、北京工商大學(xué)、軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院、中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)、中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)、華東理工大學(xué)、中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會(huì)、北京干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)研究院、蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司、琺成制藥系統(tǒng)工程(上海)有限公司、北京貝來藥業(yè)有限公司、山東泰鴻生物科技發(fā)展有限公司、昆明市延安醫(yī)院、上海市室內(nèi)環(huán)境凈化行業(yè)協(xié)會(huì)、浙江華源環(huán)境工程有限公司、天俱時(shí)工程科技集團(tuán)有限公司、杭州博岳生物技術(shù)有限公司、派歐尼爾環(huán)境凈化工程(北京)有限公司、合肥中科普瑞異生物醫(yī)藥科技有限公司、上海賽傲生物技術(shù)有限公司、唐頤控股(深圳)有限公司、浙江泰林生物技術(shù)股份有限公司、戴文工程設(shè)計(jì)(上海)有限公司、北京百普賽斯生物科技股份有限公司、上海滬試實(shí)驗(yàn)室器材股份有限公司、深圳賽動(dòng)智造科技有限公司、熙邁(上海)檢測(cè)技術(shù)服務(wù)有限公司、上海市食品藥品包裝材料測(cè)試所、東富龍生命科技有限公司、上海丹瑞生物醫(yī)藥科技有限公司、深圳市北科生物科技有限公司、北京薩姆伯科技有限公司。本文件主要起草人：馬愛進(jìn)、張毅、吳朝暉、王健、趙同標(biāo)、蔡海波、王芳、郝胤博、侯宗柳、邵小燕、1潔凈室及受控環(huán)境中細(xì)胞培養(yǎng)操作技術(shù)規(guī)范1范圍本文件規(guī)定了潔凈室及受控環(huán)境中哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)操作的要求，描述了對(duì)應(yīng)的證實(shí)方法。本文件適用于潔凈室及受控環(huán)境中哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T25915.5潔凈室及相關(guān)受控環(huán)境第5部分：運(yùn)行3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。細(xì)胞培養(yǎng)cellculture使細(xì)胞生存、生長(zhǎng)、增殖并維持其生物學(xué)特性及功能的過程。細(xì)胞培養(yǎng)中使細(xì)胞數(shù)量增加的過程。為細(xì)胞生長(zhǎng)提供更大的生長(zhǎng)空間進(jìn)行再培養(yǎng)的過程。4要求4.1環(huán)境保障4.1.1應(yīng)按GB/T25915.5的要求建立運(yùn)行體系，包括風(fēng)險(xiǎn)控制、人員培訓(xùn)、潔凈服、人員行為、室內(nèi)物流、日常清潔等方面的潔凈室運(yùn)行規(guī)范。4.1.2宜建立潔凈度、溫濕度、壓差等受控環(huán)境的自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)。4.2.1超凈工作臺(tái)/生物安全柜/隔離器等受控環(huán)境應(yīng)用紫外線或過氧化氫等消毒后再進(jìn)行培養(yǎng)操作。4.2.2應(yīng)準(zhǔn)備細(xì)胞培養(yǎng)所需試劑和耗材，包括但不限于培養(yǎng)基、生理緩沖液(PBS)、培養(yǎng)容器等。4.2.3實(shí)驗(yàn)用品、試劑耗材外包裝等應(yīng)使用適宜的消毒劑(如75%乙醇)擦拭。24.2.4培養(yǎng)基配制時(shí)，應(yīng)根據(jù)細(xì)胞來源及種類確定所需培養(yǎng)液種類以及需添加的特殊成分。配制后可采取通過0.22μm孔徑濾膜過濾等措施除菌，并選擇適宜條件保存培養(yǎng)基。若培養(yǎng)基、消化液等試劑從冰箱取出，需升溫到細(xì)胞培養(yǎng)的溫度。4.3.1人或動(dòng)物細(xì)胞實(shí)體組織原代分離時(shí)，應(yīng)在無菌獲得組織后用適當(dāng)?shù)木彌_液清洗，去除非培養(yǎng)所需組織后，用適宜的工器具(如手術(shù)刀)將組織切成若干小塊，移入無菌容器中，加入適量緩沖液，可反復(fù)剪切至適宜大小。然后根據(jù)不同細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖特性選擇機(jī)械分散、酶消化、非酶消化等適宜的方法進(jìn)行分離獲得原代細(xì)胞。4.3.2人或動(dòng)物細(xì)胞液體組織原代分離培養(yǎng)時(shí)，采用適宜的方法獲得目的細(xì)胞，然后用適當(dāng)?shù)木彌_液(如無鈣、鎂生理緩沖液)清洗，用培養(yǎng)基清洗后獲得原代細(xì)胞。4.3.3將獲得的原代細(xì)胞用緩沖液清洗，用細(xì)胞培養(yǎng)液重懸制成細(xì)胞懸液，并將細(xì)胞數(shù)目調(diào)整為所需密度分裝于培養(yǎng)容器中。4.3.4將獲得的原代細(xì)胞置于適宜的培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)至適宜細(xì)胞密度后再進(jìn)行傳代。4.4.1需純化的原代分離細(xì)胞，應(yīng)根據(jù)細(xì)胞種類、來源、培養(yǎng)要求和目的，選擇細(xì)胞因子依賴純化法、酶消化法、機(jī)械刮除法、反復(fù)貼壁法、細(xì)胞克隆技術(shù)法等適宜的細(xì)胞純化方法。4.4.2人和動(dòng)物組織(胚胎)中某些分離細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖需要有特定的細(xì)胞因子或化學(xué)小分子，宜選擇細(xì)胞因子或化學(xué)小分子依賴純化法，通過不同的培養(yǎng)體系進(jìn)行篩選純化細(xì)胞。4.4.3貼壁細(xì)胞宜選擇酶消化法或機(jī)械刮除法進(jìn)行純化。4.4.4懸浮細(xì)胞宜采用磁珠分選/流式細(xì)胞術(shù)分選等適宜純化方法。4.4.5胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞等宜選擇細(xì)胞克隆法進(jìn)行純化。4.5傳代與擴(kuò)增4.5.1細(xì)胞生長(zhǎng)到一定密度需要傳代時(shí)，貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞宜選擇酶消化法傳代；懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞宜選擇離心法、半量換液法等傳代；收集獲得的細(xì)胞計(jì)數(shù)后，根據(jù)細(xì)胞類型選擇適宜的接種密度進(jìn)行培養(yǎng)。4.5.2細(xì)胞需要連續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)時(shí)，應(yīng)根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)的狀態(tài)和細(xì)胞培養(yǎng)預(yù)定目的要求進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)換液或補(bǔ)液。4.6.1需要凍存的細(xì)胞，應(yīng)根據(jù)細(xì)胞特性，選擇狀態(tài)良好的細(xì)胞如對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，將其制備成懸液，計(jì)數(shù)，并根據(jù)具體凍存要求調(diào)整細(xì)胞密度進(jìn)行凍存。4.6.2應(yīng)選擇適宜的冷凍保護(hù)劑、冷凍方法和冷凍溫度進(jìn)行凍存。凍存的細(xì)胞若需培養(yǎng)，超凈工作臺(tái)應(yīng)將細(xì)胞懸液與預(yù)熱培養(yǎng)基混勻后離心棄上清，然后用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀至適宜生長(zhǎng)密度后進(jìn)行培養(yǎng)。4.8其他4.8.1對(duì)于培養(yǎng)的細(xì)胞，應(yīng)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒別和對(duì)細(xì)胞中細(xì)菌、真菌、支原體等進(jìn)行檢測(cè)，并根據(jù)需要，對(duì)純度、生物學(xué)特性、功能特性、病毒和內(nèi)毒素等指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。34.8.2培養(yǎng)操作完成后，需要移除的物品應(yīng)移出超凈工作臺(tái)/生物安全柜。4.8.3應(yīng)使用適宜的消毒劑進(jìn)行消毒，如用75%乙醇擦拭超凈工作臺(tái)/生物安全柜臺(tái)面后紫外滅菌。4.8.4廢物分類放入專用容器中按照廢物類別進(jìn)行相應(yīng)處理。5證實(shí)方法5.1細(xì)胞純度宜按照GB/T39729進(jìn)行檢測(cè)。5.