蝦肝腸胞蟲核酸檢測技術(shù)規(guī)范

DB33/TXXXX—20XX

蝦肝腸胞蟲核酸檢測技術(shù)規(guī)范

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了蝦肝腸胞蟲（Enterocytozoonhepatopenaei）套式PCR檢測、SYBR熒光定

量PCR檢測、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）檢測方法所需試劑和材料、儀器和設(shè)備、操作步驟和

結(jié)果判定。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于蝦類、餌料生物、養(yǎng)殖水體及浮游動(dòng)物等樣品中蝦肝腸胞蟲的檢測和監(jiān)測。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本標(biāo)準(zhǔn)必不可少的條款。其中，注日期

的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)；不注日期的引用文件，其最新版本（包括

所有的修改單）適用于本標(biāo)準(zhǔn)。

SC/T7103水生動(dòng)物產(chǎn)地檢疫采樣技術(shù)規(guī)范

3術(shù)語和定義

本標(biāo)準(zhǔn)沒有需要界定的術(shù)語和定義。

4縮略語

BstDNA聚合酶：BstDNAPolymerase

bp：堿基對（basepair）

DNA：脫氧核糖核酸（deoxyriboNucleicacid）

dNTP：脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate）

EHP：蝦肝腸胞蟲Enterocytozoonheppenatoaei

LAMP：環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loop-MediatedIsothermalAmplification）

PCR：聚合酶鏈反應(yīng)polymerasechainreaction

SWP：孢子壁蛋白（sporewallprotein）

TAE緩沖液：由三羥甲基氨基甲烷(Trisbase)、乙酸(aceticacid)和乙二胺四乙酸(EDTA)

組成的緩沖液

SYBRGreenqPCRMix：含雙鏈嵌合熒光染色劑的熒光定量PCR預(yù)混液。

5試劑和材料

5.1除非另有說明，在分析中僅使用確認(rèn)為分析純的化學(xué)試劑和蒸餾水或去離子水或相當(dāng)

純度的水。

5.2無水乙醇。

5.395%乙醇見附錄A。

5.470%乙醇見附錄A。

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5.50.45μm硝酸纖維素膜。

5.63%牛肉膏洗脫液見附錄A。

5.716%PEG8000見附錄A。

5.80.2mol/L磷酸氫二鈉(Na2HPO4）見附錄A。

5.9抽提緩沖液：見附錄A。

5.10蛋白酶K：見附錄A。

5.11平衡酚、10mol/L乙酸銨、酚/三氯甲烷/異戊醇（25:24:1）、三氯甲烷/異戊醇（24:1）。

5.12TE緩沖液：見附錄A。

5.13TaqDNA聚合酶（5U/μL）：生化試劑，-20℃保存，避免反復(fù)凍融。

5.1410×PCR緩沖液：生化試劑，隨TaqDNA聚合酶提供，-20℃保存。

5.15氯化鎂（Mgcl2）溶液（25mmol/L）：生化試劑，-20℃保存。

5.16dNTP：生化試劑，含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10mmol/L的混合物，-20℃保存。

5.17套式引物：套式兩對引物，使用濃度均為10μmol/L，-20℃保存。

1）F514：5’-TTGCAGAGTGTTGTTAAGGGTTT-3’；

2）R514：5’-CACGATGTGTCTTTGCAATTTTC-3’，擴(kuò)增514bp的片段；

3）F147：5’-TTGGCGGCACAATTCTCAAACA-3’；

4）R147：5’-GCTGTTTGTCTCCAACTGTATTTGA-3’，擴(kuò)增上述片段中的147bp片段。

5.181×TAE電泳緩沖液：見附錄A。

5.19瓊脂糖：電泳級。

5.20樣品緩沖液：見附錄A。

5.21電泳核酸染料，生化制劑。

5.22DNAMarker。

5.23SYBRGreenqPCRMix。

5.24熒光PCR引物，使用濃度為10μmol/L，-20℃保存。

1）F118：5’-ACAAAGTTACCAGAAGGTTATGAAG-3’；

2）R118：5’-TTGTGCCGCCAAACTCGTA-3’。

5.2510×thermal緩沖液。

5.26甜菜堿，5mol/L。

5.27硫酸鎂，150mmol/L。

5.28BstDNA聚合酶，8U/μL。

5.29環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物：

1）F3：5’-TAGAAGATGCAAAGAGATATGTTGA-3’（10μmol/L）；

2）B3：5’-GTTTGTCTCCAACTGTATTTGAAA-3’（10μmol/L）；

3）FIP：5’-TTACTTAAACCCTTAACAACACTCTAAGTTACCAGAAGGTTATGAAG

AA-3’（40μmol/L）；

4）BIP：5’-TTGGCGGCACAATTCTCAATGTCTGTGTAAATATCGTCTCTTT-3’（40μmol/L）；

5）FLP：5’-AACATTTAGTTCGTCACGCATTT-3’（40μmol/L）；

6）BLP：5’-TTCAAACACTGTAAACCTTAAAGCA-3’（40μmol/L）。

5.30陽性對照：已知受EHP感染的對蝦樣品提取的DNA，-20℃保存。

5.31陰性對照：不含EHP的對蝦樣品提取的DNA，-20℃保存。

5.32空白對照：無菌雙蒸水。

6儀器和設(shè)備

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6.1PCR擴(kuò)增儀。

6.2熒光定量PCR儀。

6.3恒溫?zé)晒鈹U(kuò)增檢測儀。

6.4電泳儀：輸出直流電壓0V～600V。

6.5水平電泳槽：50mL～500mL，帶有凝膠船及樣孔梳。

6.6微量移液器及適配吸頭，建議使用帶濾芯的吸頭。

6.7凝膠成像儀。

6.8恒溫培養(yǎng)箱或金屬浴。

6.9普通冰箱：具冷藏箱，并帶-18℃以下冷凍箱體。

6.10離心機(jī)：轉(zhuǎn)速可達(dá)12000r/min以上。

6.11超聲破碎儀。

6.125mL、0.2mLPCR管及1.5mL離心管：經(jīng)高壓滅菌，一次性使用。

6.13無菌研磨棒：適用于1.5mL離心管，經(jīng)高壓滅菌，一次性使用。

7樣品采集和處理

7.1樣品的采集

樣品采集的要求和數(shù)量按SC/T7103的規(guī)定。

活體或冷凍幼體、仔蝦及體長3cm以下稚蝦個(gè)體樣品約5mg～100mg；活體或冷凍蝦

的肝胰腺5mg～100mg；活體或冰凍餌料生物樣品5mg～100mg。4℃運(yùn)輸盡快進(jìn)行核酸抽

提，或置于滅菌采樣容器內(nèi)，加入待檢樣三倍體積的95%乙醇沒過待檢樣，-20℃保存。

水樣用無菌容器采集100mL～500mL，4℃運(yùn)輸盡快進(jìn)行核酸抽提，如未能及時(shí)檢測，

應(yīng)將水樣置于-20℃冰柜保存待檢。

7.2樣品處理

7.2.1通用要求

樣品處理過程中應(yīng)避免交叉污染。

7.2.2生物樣

取樣品置于滅菌1.5mL的離心管中，用研磨棒研磨均勻，用于核酸提取。

7.2.3水樣

7.2.3.1取100mL水樣經(jīng)0.45μm硝酸纖維素膜過濾后，取出硝酸纖維素膜并剪碎，放入

裝有1.5mL的3%牛肉膏洗脫液及鋯珠的2mL樣品處理管中，震蕩20min～30min，或用超

聲破碎儀破碎15min。

7.2.3.2取出上清轉(zhuǎn)移至干凈的5mL離心管中。加入等體積的16%PEG8000溶液，震蕩充

分混勻，調(diào)節(jié)pH至7.0，4℃靜置2h～3h，或靜置過夜。

7.2.3.34℃下12000r/min離心5min，棄上清。加入500μL0.2mol/LNa2HPO4，振蕩

至重懸沉淀。

7.2.3.44℃下12000r/min離心5min，取上清用于核酸抽提。

8核酸抽提

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8.1經(jīng)6.2處理樣品，按以下方法進(jìn)行核酸抽提，也可采用同等效果商業(yè)化DNA提取試劑

盒抽提DNA。

8.2加入450μL的抽提緩沖液、3μL蛋白酶K（20mg/mL），混勻，56℃孵育3h。

8.3冷卻至室溫，加入等體積平衡酚，顛倒混合10min，于10000r/min離心3min，取

上層水相至新1.5mL離心管中。

8.4加入等體積酚/三氯甲烷/異戊醇（25:24:1），顛倒混合10min，于10000r/min離

心1min，取上層水相至新1.5mL離心管中。

8.5加溶液等體積三氯甲烷/異戊醇(24:1)，顛倒混合10min，于10000r/min離心1min，

取上層水相至新1.5mL離心管中。

8.6加入100μL10mol/L乙酸銨，混勻后，再加入兩倍體積預(yù)冷無水乙醇(-20℃）混

勻，-20℃放置2h。10000r/min離心10min，棄上清。

8.7用70%乙醇洗滌沉淀2次，每次洗滌后10000r/min離心5min，小心傾去上清，沉

淀于室溫晾干。

8.8加入50μL～100μL滅菌雙蒸水溶解DNA。若DNA樣品需保存，建議用50μL～100

μLTE緩沖液溶解并保存于-20℃。

9套式PCR

9.1通用要求

樣品的PCR擴(kuò)增應(yīng)在PCR反應(yīng)區(qū)獨(dú)立完成，避免造成區(qū)域間污染。PCR檢測產(chǎn)物序列見附

錄B。

9.2第一步PCR反應(yīng)

在0.2mLPCR管中加入10×PCR緩沖液2.5μL、25mmol/LMgcl21.5μL、dNTP0.5μL、

引物F514和R514各1μL、Taq酶0.1μL、待測模板DNA1μL，最后加滅菌雙蒸水至25μL

體積（或者按商品化預(yù)混液說明書配制反應(yīng)體系）。同時(shí)設(shè)陽性對照、陰性對照及空白對照。

短暫離心后將PCR管置于PCR儀中，按以下程序進(jìn)行擴(kuò)增：95℃5min；95℃30s,，58℃

30s，68℃45s，30次循環(huán)；68℃5min；4℃保溫。

9.3第二步PCR反應(yīng)

在0.2mLPCR管中加入10×PCR緩沖液2.5μL、25mmol/L氯化鎂1.5μL、dNTP0.5μL、

引物F148和R148各1μL、Taq酶0.1μL、第一輪反應(yīng)產(chǎn)物1μL，最后加滅菌雙蒸水至25μ

L體積（或按商品化預(yù)混液說明書配制反應(yīng)體系）。短暫離心后將PCR管置于PCR儀中，按以

下程序進(jìn)行擴(kuò)增：95℃5min；95℃30s,，64℃30s，68℃20s，20次循環(huán)；68℃5min；

4℃保溫。

9.4瓊脂糖凝膠電泳

用1×TAE電泳緩沖液配制1.5%且含1μg/mL核酸染料的瓊脂糖凝膠。將該凝膠平板放

入水平電泳槽，加樣孔朝負(fù)極，加入1×TAE電泳緩沖液至沒過膠面1mm～2mm。將6μLPCR

擴(kuò)增產(chǎn)物和2μL樣品緩沖液混勻后加入加樣孔。同時(shí)設(shè)立DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)對照。5V/cm電泳

30min，當(dāng)溴酚藍(lán)遷移至瓊脂糖凝膠的1/2～2/3處時(shí)停止電泳，凝膠成像儀觀察并判斷結(jié)果。

9.5結(jié)果判定

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9.5.1陽性對照第一步PCR在514bp處有條帶，或/和第二步PCR在147bp處有條帶，陰

性對照和空白對照沒有相應(yīng)條帶，實(shí)驗(yàn)有效。

9.5.2待測樣品第一步PCR在514bp處有條帶或/和第二步PCR在147bp處有條帶的，均

判定為陽性。

9.5.3待測樣品第一步PCR在514bp處無條帶且第二步PCR在147bp處均無條帶的可判

定為樣品陰性。

10熒光定量PCR

10.1通用要求

樣品的熒光PCR擴(kuò)增應(yīng)在PCR反應(yīng)區(qū)獨(dú)立完成，避免造成區(qū)域間污染。熒光定量PCR檢測

產(chǎn)物序列見附錄C。

10.2反應(yīng)體系

在熒光PCR小管中加入2×SYBRGreenqPCRMix10μL，引物F118和R118各0.8μ

L，待檢樣品DNA1μL，最后加滅菌雙蒸水至20μL體積。（或者按商品化預(yù)混液說明書

配制反應(yīng)體系）。同時(shí)設(shè)陽性對照、陰性對照及空白對照。低速離心后將PCR管置于熒光定

量PCR儀中，按以下程序進(jìn)行擴(kuò)增：95℃30s；95℃5s，60℃30s，40個(gè)循環(huán)。

10.3結(jié)果判定

10.3.1陽性對照Ct值≤30且有明顯S型擴(kuò)增曲線，同時(shí)陰性對照和空白對照Ct＞30且無

明顯S型擴(kuò)增曲線，判斷結(jié)果有效。

10.3.2待測樣品Ct值≤30且有明顯S型擴(kuò)增曲線，結(jié)果為陽性。

10.3.3待測樣品Ct值＞35或無明顯S型擴(kuò)增曲線，結(jié)果為陰性。

10.3.4待測樣品Ct值30≤Ct≤35時(shí)，樣品為疑似陽性，應(yīng)重新檢測。

11LAMP檢測

11.1通用要求

樣品的LAMP檢測應(yīng)在PCR反應(yīng)區(qū)獨(dú)立完成，避免造成區(qū)域間污染。

11.2反應(yīng)體系

在熒光PCR小管中按表1體系加入各種試劑（或者按商品化預(yù)混液說明書配制反應(yīng)體

系）。同時(shí)設(shè)陽性對照、陰性對照及空白對照。低速離心后將PCR管置于熒光定量PCR儀或

恒溫?zé)晒釶CR儀中，63℃擴(kuò)增40min。

表1環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系表

組分工作液濃度加樣量（μL）反應(yīng)體系終濃度

ThermoPol緩沖液10×2.51×

外側(cè)上游引物（F3）10μmol/L0.50.2μmol/L

外側(cè)下游引物（B3）10μmol/L0.50.2μmol/L

內(nèi)側(cè)上游引物（FIP）40μmol/L1.01.6μmol/L

內(nèi)側(cè)下游引物（BIP）40μmol/L1.01.6μmol/L

環(huán)引物（FLP）40μmol/L0.50.8μmol/L

環(huán)引物（BLP）40μmol/L0.50.8μmol/L

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表1環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系表（續(xù)）

組分工作液濃度加樣量（μL）反應(yīng)體系終濃度

dNTPs10mmol/L41.6mmol/L

甜菜堿5mol/L40.8mol/L

硫酸鎂150mmol/L16mmol/L

BstDNA聚合酶8U/μL10.32U/μL

DNA模板100ng/μL28ng/μL

水―6.5―

總體積―25―

11.3結(jié)果判定

11.3.1陽性對照反應(yīng)產(chǎn)生典型S型擴(kuò)增曲線且陰性對照和空白對照反應(yīng)產(chǎn)生非S型擴(kuò)增曲

線時(shí)，結(jié)果有效。

11.3.2待測樣品反應(yīng)產(chǎn)生典型S型擴(kuò)增曲線，結(jié)果為陽性。

11.3.3待測樣品反應(yīng)產(chǎn)生類似平直的非S型擴(kuò)增曲線，則結(jié)果為陰性。

12綜合判定

12.1套式PCR結(jié)果陽性，熒光定量PCR結(jié)果陽性，或LAMP檢測結(jié)果陽性，符合其中一項(xiàng)

則判定為樣品EHP陽性。

12.2當(dāng)套式PCR、熒光定量PCR、LAMP檢測中的一種檢測方法結(jié)果判定可疑時(shí)，選擇另一

種進(jìn)行確認(rèn)。

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附錄A

（資料性）

試劑配制

A.170%乙醇

無水乙醇70mL

加水30mL，混勻，定容至100mL

室溫保存。

A.295%乙醇

無水乙醇95mL

加水5mL，混勻，定容至100mL

室溫保存。

A.33%牛肉膏洗脫液（pH9.0）

牛肉浸膏30.0g

加水溶解，調(diào)節(jié)pH至9.0，定容至1000mL

高壓滅菌15min，室溫保存。

A.416%PEG8000溶液

PEG8000160.0g

NaCl17.5g

加水溶解，定容至1000mL

高壓滅菌15min，室溫保存。

A.50.2mol/L的Na2HPO4（pH9.0）

Na2HPO4·12H2O，71.6g

加水溶解，調(diào)節(jié)pH至9.0，定容至1000mL

高壓滅菌15min，室溫保存。

A.6抽提緩沖液

1mol/LTris·HCl(pH8.0)1mL

0.5mol/LEDTA(pH8.0)20mL

1mg/mL胰RNA酶2mL

10%SDS5mL

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加水定容至100mL

混勻，室溫貯存。

A.720mg/mL蛋白酶K

蛋白酶K20mg

水1mL

溶解后分裝于無菌離心管中(0.25mL/管)，-20℃下保存。

A.8TE緩沖液

1mol/LTris·HCl(pH8.0)10mL

0.5mol/LEDTA(pH8.0)2mL

加水定容至1000mL

高壓滅菌，4℃保存。

A.950×電泳緩沖液

Tris242g

0.5mol/LEDTA(pH8.0)100mL

冰乙酸57.1mL

加水定容至1000mL

室溫保存，使用時(shí)稀釋50倍。

A.10樣品緩沖液

蔗糖40g

加水溶解，定容至1000mL

溴酚藍(lán)0.25g

溶解后，4℃保存。

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附錄B

（資料性）

蝦腸胞蟲（EHP）SWP基因套式PCR檢測產(chǎn)物序列

ATGTTAGAAGATGCAAAGAGATATGTTGAAAGAAAAATTAAAAAAATTGAATACATTCATACAAAGTTACCAGAAGGTT

ATGAAGAAAAACAAAACAGGTACAGAAAAATGCGTGACGAACTAAATGTTTTGCAGAGTGTTGTTAAGGGTTTAAGTAA

F514

TTACGAGTTTGGCGGCACAATTCTCAAACATTTTCACCATTGGTCAAATACAATTTCAAACACTGTAAACCTTAAAGCA

F147

TTAAAAAGAGACGATATTTACACAGACACAGCATTTGTAGGATATGAGCTTTCAAATACAGTTGGAGACAAACAGCTTA

R147

AAGAAGTTTGCAATGATTTTTCTAAAGCATATGAATGCATATCAGAAGATAAAAGGAAAATGAATGAAAAAATGGGAGA

TATTTTTGAAGAATTAAGTATTTTAAAAAAGAAGTGCAAACAAATTGATCATCAACGCAAAACTGTAAATAACCTAAGA

TATGATTTAGAAGAAATATTGCAATCAAACATTTATAAAGAAGATCAAAAAGAAAATTTAGAAAAAAAATTAGGAGAAA

CATCTGAAAAAACACTAGTAGAAATGGATGAATTTATGCATTTAAGTATGATAAATGGAGTAATCAAGAAAATTGCAAA