液相色譜和氣相色譜的異同 液相色譜操作規(guī)程

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色譜法是一種常見的分別技術(shù)，其原理是利用欲分別組分在兩相間具備不同的調(diào)配系數(shù)，以流動相對固定相中的混合物進(jìn)行洗脫，混合物中的不同物質(zhì)以不同速度沿固定相移動，終達(dá)到分別的效果。

按兩相的物理狀態(tài)，可以分為氣相色譜法（GC）和液相色譜法（LC），在現(xiàn)代樣品分析中，氣相色譜和液相色譜都是普遍接受的分析方法，但兩者也存在很多不同之處，具備不同的特性，這些特性也決議了它們不同的應(yīng)用范圍。

一、GC與LC的緊要差異

1.流動相區(qū)分

GC：流動相為惰性氣體，流動相與組分無親合作用力，只與固定相有相互作用。

LC：流動相為液體，流動相與組分間有親合作用。

2.色譜柱長度區(qū)分

GC：色譜柱長度在幾米到幾十米不等。氣相色譜由于載氣的相對分析量較低，分子間隙大，故粘度低，流動性好，組分在氣相中流動速度快，因此可以加添柱長，以提高柱效。

LC：色譜柱通常在幾十到幾百毫米。

3.分析樣品選擇性

GC：相對分子質(zhì)量較小（一般小于1000），低沸點(diǎn)（一般小于500℃），易揮發(fā)，熱穩(wěn)定性。

LC：更適用于分析高沸點(diǎn)，難揮發(fā),熱穩(wěn)定性差，分子質(zhì)量較大（1000——2000）的液體化合物。

據(jù)統(tǒng)計(jì)，氣相色譜能分析的有機(jī)物只占全部有機(jī)物的15%—20%，其可分析樣品的范圍小于液相色譜，但隨著近幾年技術(shù)的更新，如頂空進(jìn)樣和裂解進(jìn)樣等，進(jìn)一步擴(kuò)大了氣相色譜的分析范圍。

4.檢測器差異

GC：氫火焰離子化檢測器（FID），熱導(dǎo)檢測器（TCD），電子捕獲檢測器（ECD），火焰光度檢測器（FPD），氮磷檢測器（NPD）。

LC：紫外檢測器，熒光檢測器，示差折光檢測器。

5.其他方面

GC：需要將樣品在氣化室氣化，需要較高的檢測溫度，接受尖頭進(jìn)樣針。

LC：不必對樣品氣化，常溫即可檢測，接受平頭進(jìn)樣針。

YL6500GC氣相色譜儀

二、GC與LC的緊要相同點(diǎn)

基本的原理相同，都是吸附—脫附平衡，利用組分在固定相和流動相中的調(diào)配系數(shù)不同達(dá)到分別的目的。也就是說，兩者都是利用物質(zhì)在流動相和固定相中的調(diào)配系數(shù)的差別，從而在兩相間反復(fù)多次（1000—1000000次，甚至更多）的調(diào)配，使原來調(diào)配系數(shù)差別很小的各組分分別開來。在本質(zhì)上，都是利用“相像相溶”原理，利用色譜柱進(jìn)行分別。

YL9100液相色譜儀

三、小結(jié)

氣相色譜具有分別效率高，分別速度快，樣品用量少，選擇性好，檢測靈敏度高等特點(diǎn)，在食品、環(huán)境、化工等領(lǐng)域都具有廣泛的用途；液相色譜分析范圍廣，對于難分別混合物的分析具有很好的精準(zhǔn)性，樣品回收簡單，因此液相色譜不僅僅作為一種分析方法，也作為一種分別手段應(yīng)用在食品醫(yī)藥等行業(yè)。

隨著應(yīng)用領(lǐng)域的不斷深入，單一的色譜分析技術(shù)已經(jīng)不能完全充分現(xiàn)有的市場需求，所以誕生了氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（GCMS）、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LCMS）等新的分析技術(shù)，用于更好地分別分析樣品。

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高效液相色譜儀操作三要點(diǎn)

高效液相（HPLC）現(xiàn)已成為有機(jī)化學(xué)分析的緊要手段之一、同樣，在食品分析中，無論是殘留分析還是成分分析，HPLC也已成為不可或缺的。和其它分析一樣，你若想讓HPLC很好地為你工作、得到牢靠的數(shù)據(jù)，首先你要保養(yǎng)好它，使它處于一個良好的待機(jī)狀態(tài)，這樣你操作它進(jìn)行分析時就可以比較順當(dāng)?shù)孬@得理想的結(jié)果。而且良好規(guī)范的操作習(xí)慣可以延長儀器使用壽命。大家在學(xué)校或接受儀器公司培訓(xùn)的時候，老師或工程師會提出很多的操作注意事項(xiàng)。但要是總結(jié)歸納一下，緊要的有三點(diǎn)：脫氣、過濾和沖洗。本文圍繞這三點(diǎn)進(jìn)行討論，給新從事HPLC分析的工一點(diǎn)操作建議，希望能對正確的操作儀器有一點(diǎn)幫忙。

一、脫氣

流動相脫氣對于避開HPLC系統(tǒng)出問題，順當(dāng)?shù)玫揭粋€理想的數(shù)據(jù)是一個很有效的措施。HPLC系統(tǒng)內(nèi)是不希望有氣泡存在的。HPLC泵在輸送液體時要產(chǎn)生很大的氣力，由于氣體的壓縮比與液體相比大的多，因而當(dāng)氣泡存在時，你將察看到瞬間的流速降低和系統(tǒng)壓力下降。假如這個氣泡充分大，液相泵將不能輸送任何溶劑，而且假如壓力低于預(yù)先設(shè)定的壓力低限，泵將停止工作。有些泵設(shè)計(jì)可以很好地排出氣泡，而也有一些泵設(shè)計(jì)當(dāng)氣泡存在時將停止運(yùn)轉(zhuǎn)。

當(dāng)一個氣泡通過輸液泵時，由于系統(tǒng)壓力大，氣泡通常會溶解在流動相溶液中，隨流動相通過柱子。但是到達(dá)檢測器流通池時系統(tǒng)壓力又恢復(fù)到了大氣壓，因而氣泡可能在檢測器流通池中又顯現(xiàn)，在色譜圖上會顯現(xiàn)不規(guī)律的毛刺。為解決這個問題，有些儀器公司設(shè)計(jì)一個反壓掌控器，這樣可以在檢測器出口供應(yīng)充分的壓力保持氣泡始終溶解在流動相中直到它們流出檢測器。當(dāng)然，這個壓力不能超過流通池所能承受的壓力極限，否則可能損壞檢測器。

紫外/可見光（UV/VIS）檢測器的液相色譜圖中的噪音毛刺通常是氣泡進(jìn)入并通過流通池的征兆。有些檢測器對空氣的存在也特別敏感，但表現(xiàn)出的征兆與UV/VIS不同，例如有報導(dǎo)說，當(dāng)使用熒光（FL）檢測器時，流動相中溶解氧的存在可能會使一些化合物失去熒光性。此外，對于利用待測物質(zhì)在電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)引起電流變化而進(jìn)行檢測的電化學(xué)（EC）檢測器，對流動相中的溶解氧的存在也特別靈敏。此外，氣泡的存在有時還會導(dǎo)致保留時間不重現(xiàn)。

所以，必需注意除去流動相中的空氣，并且還應(yīng)避開空氣由管路（如PTFE管）滲透進(jìn)流動相中。

假如適當(dāng)?shù)仃P(guān)注在使用之前脫去流動相中溶解進(jìn)的空氣，上述這些問題均能避開，或把影響降至最低。常用的脫氣方法有如下幾種：

1.吹氦脫氣法。利用氦氣在液體中溶解度比空氣低的特性，在0.1MPa壓力下，以約60mL/min流速通入流動相儲液容器中10～15min，可以很有效地從流動相中排出溶解的空氣，能排出接近80%的氧氣。接受一個高效分布式噴射流裝置，一體積的氦氣可從流動相中將等體積的幾乎全部氣體排出。這意味著1L氦氣通過1L流動相就可完成排氣這個工作。這種脫氣方法雖然好，但我們國內(nèi)氦氣價格較高，很少有試驗(yàn)室接受此方法。

2.加熱回流法。此法的脫氣效果較好。在操作時要注意冷凝塔的冷卻效率，否則溶劑會丟失，混合流動相的比例會有變化。

3.抽真空脫氣法。此法可使用真空泵，降壓至0.05～0.07MPa即可除去溶解的氣體。但是由于真空脫氣會使混合溶劑構(gòu)成發(fā)生變化，從而影響到試驗(yàn)的重現(xiàn)性，因此多用于單溶劑體系的簡單分析。

4.超聲波脫氣法。將欲脫氣的流動相置于超聲波清洗器中，用超聲波震蕩10～20min。此法的脫氣效果最差。

5.在線脫氣法?，F(xiàn)在商品的HPLC儀器，均可配在線脫氣機(jī)。在線脫氣使用簡單，低故障，有效。建議購買儀器時確定要購買，有的公司是作為選購件，所以與儀器公司談配置時應(yīng)與公司確認(rèn)。

二、過濾

任何顆粒物進(jìn)入HPLC系統(tǒng)后都會在柱子入口端被篩板擋住，最后的結(jié)果是將柱子堵塞，表現(xiàn)出的特征是系統(tǒng)壓力加添并使色譜峰變形。因此，要實(shí)行各種防備措施，包括操作步驟和商品儀器自身的各種過濾設(shè)計(jì)，努力防止或削減顆粒物進(jìn)入HPLC系統(tǒng)中，從而延長儀器和色譜柱的使用壽命，并提高數(shù)據(jù)的牢靠性。在HPLC系統(tǒng)中，顆粒物的緊要來源有三個途徑：流動相、被測樣品和儀器系統(tǒng)部件的磨損物。

1、流動相

假如流動相均由高效液相色譜級溶劑構(gòu)成，流動相沒有必要過濾。這是由于高效液相色譜級的有機(jī)溶劑，例如乙腈、甲醇等，在制造的工藝過程中都已經(jīng)過了0.2μm微孔濾膜過濾。同樣的，無論你是買的HPLC級的水還是在試驗(yàn)室使用超純水凈化系統(tǒng)制備的水，最后一步也是通過0.2μm微孔濾膜。然而，假如有任何一種緩沖液中加入了固體物，例如磷酸鹽，流動相過濾將是必要的一個步驟。雖然緩沖鹽可能是可溶解的、高純的，但它還是可能含有顆粒物質(zhì)，例如在蓋試劑瓶的塑料內(nèi)蓋時，塑料瓶蓋子與瓶口邊緣擠壓就會產(chǎn)生塑料顆粒。在這種情況下，添加的一種固體物可能完全溶解了，但是少量雜質(zhì)顆粒存在于流動相中成為殘?jiān)?/p>

流動相通過0.45μm微孔濾膜過濾對于從流動相中除去全部顆粒物是一個有效方法。0.2μm微孔濾膜也可以用，但是它們就這個應(yīng)用而言并不比0.45μm微孔濾膜更有效，而且它的過濾速度會更慢，特別是當(dāng)試驗(yàn)室使用的試劑和水的質(zhì)量不太好時。建議試驗(yàn)室在編寫訂立他們流動相制備標(biāo)準(zhǔn)操作程序（SOPs）時規(guī)定，可以借鑒國際上同類試驗(yàn)室的規(guī)定，即：

流動相制備僅接受HPLC級液體時不需要過濾，反之全部流動相構(gòu)成在使用前必需過濾。

在連接儲液瓶和泵的輸液管的末端入口接受下沉式過濾器（常見材質(zhì)有熔融玻璃砂芯濾板和微孔金屬的兩種）也是很緊要的。這個過濾器的規(guī)格為≥10μm的微孔物質(zhì)，所以它不能取代流動相過濾步驟，但是它能除去系統(tǒng)中的塵土并保證儲液瓶、輸液管使用的牢靠性。

2、被測樣品

液相系統(tǒng)中的第二個顆粒物來源是被測樣品。一些試驗(yàn)室在將他們的樣品放置在自動進(jìn)樣器盤（或手動進(jìn)樣）以前，全部樣品都先通過一個0.45μm針筒式過濾器過濾。這是一個有效除去被測樣品中顆粒物的方法。但是這個過程也有一點(diǎn)需要關(guān)注：你使用了針筒式過濾器就不可能100%得到通過過濾器的被測樣品，總會有或多或少的丟失。丟失來自這樣幾方面：過濾器濾膜的吸附、過濾器濾出的顆粒物上的吸附、針筒式濾膜過濾器與針筒連接處的滲漏等。假如有丟失，過濾后液體中被測物的含量或濃度與原基本樣液的含量或濃度還相同嗎？這個問題一般需要通過試驗(yàn)確認(rèn)。確認(rèn)這步是要加添工作量和費(fèi)用的。過濾器的使用是一種消耗，每個過濾器的價格從幾元到十幾元。但在做食品中殘留物分析時，由于基質(zhì)大多比較多而雜，所以過濾這步已成為不可或缺的一步。在實(shí)際分析工作中，一般檢測每一組樣品會帶一個外標(biāo)、一個添加回收或是質(zhì)控樣品，所以，只要最后檢測時得到的信噪比能充分檢出限要求，可將這步視為系統(tǒng)誤差而疏忽。

3、系統(tǒng)部件的磨損物

最后，在HPLC系統(tǒng)中顆粒物的另一個緊要來源是輸液泵密封墊和進(jìn)樣閥旋轉(zhuǎn)軸的磨損。關(guān)于輸液泵密封墊的磨損更換有兩種不同建議。

第一種建議認(rèn)為，在一般試驗(yàn)室中輸液泵密封墊通常使用壽命為六個月到一年，因此建議半年或一年更換這些密封墊，試驗(yàn)室應(yīng)基于上述觀點(diǎn)訂立定期防備性維護(hù)計(jì)劃。該觀點(diǎn)認(rèn)為：與輸液泵密封墊顆粒堵塞柱子而更換新柱子的費(fèi)用相比，更換密封墊的費(fèi)用低些。一些輸液泵有玻璃砂芯或篩網(wǎng)，可在流路中濾掉從泵密封墊磨損下來的顆粒物，防止這些顆粒物隨流動相流至柱頭。若有這種裝置應(yīng)查閱輸液泵操作手冊，查看推舉的這種過濾器清洗或更換的間隔。

另一種建議則認(rèn)為，原裝密封墊的密封效果可以，更換以后簡單引起流動相滲漏。所以，只要不漏液就不要輕易更換密封墊。

兩種說法都有其道理，實(shí)在如何操作，建議與儀器公司工程師溝通，各公司的儀器還是有些不同的。

自動進(jìn)樣器旋轉(zhuǎn)軸的密封隨著使用時間也會磨損，但是在我的閱歷中，即便是高負(fù)荷的運(yùn)轉(zhuǎn)旋轉(zhuǎn)軸密封墊也可以使用幾年。假如你的自動進(jìn)樣器系統(tǒng)有計(jì)數(shù)進(jìn)樣閥轉(zhuǎn)動次數(shù)的功能，你可以設(shè)定一個警鈴當(dāng)預(yù)設(shè)閥轉(zhuǎn)動次數(shù)已達(dá)到時提示你。曾有一種說法，進(jìn)樣器較多轉(zhuǎn)動20，000次，這僅僅是進(jìn)樣10000個；但這相像不是試驗(yàn)室涉及的常規(guī)樣品分析使用壽命，它們的實(shí)際使用壽命會更長。旋轉(zhuǎn)軸密封磨損后會滲液，比較明顯的特征是同一樣品多次進(jìn)樣后，峰面積值差別比較大（RSD》5%）。當(dāng)然，輸液泵的密封墊和旋轉(zhuǎn)軸的密封墊磨損將加添更多研磨物在流動相中，加速對這些部件的損傷。此外，假如你日常運(yùn)行的流動相有緩沖鹽，如磷酸緩沖鹽，密封墊的磨損會更快。

無論顆粒物源于何物，試驗(yàn)時都要將其除去。推舉在HPLC系統(tǒng)中接受一個0.45或0.5μm的在線多孔過濾器，接在自動進(jìn)樣器和柱子之間，即使已使用了保護(hù)柱。這個在線過濾器將成為擋板代替柱頭的濾板，而且如接受一個玻璃砂芯濾板，既便宜，更換又便利（幾分鐘就可更換）。若接受在線過濾，HPLC系統(tǒng)檢測每批樣品開始前記錄下壓力值，當(dāng)壓力上升確定值，例如25%或加添500psi，應(yīng)當(dāng)更換玻璃砂芯濾板了，更換以后沖洗幾分鐘系統(tǒng)將恢復(fù)到原來的壓力值。

三、沖洗

使HPLC系統(tǒng)良好運(yùn)行的第三個要點(diǎn)是保持系統(tǒng)的清潔。你需要關(guān)注流動相流經(jīng)該系統(tǒng)的全部地方，對于這些地方常常性的沖洗，將使你的系統(tǒng)保持在“Ready”狀態(tài)。

1、流動相儲液瓶

首先要常常清洗流動相儲液瓶，或者每做一批新樣品更換一次流動相。一個臟的儲液瓶將會污染注入的流動相。建議儲液瓶中緩沖液使用時間不要超過一周，而有機(jī)溶劑使用時間不要超過一個月。也有人建議儲液瓶中保持用溶劑充分，直到更換分析方法儲液瓶需更換新溶劑（流動相構(gòu)成發(fā)生變化）時，將舊溶劑倒掉更換新溶劑，這樣勝于將溶劑用完。但這對于分析樣品量少的試驗(yàn)室而言相像有些揮霍。儀器公司的工程師建議儲水瓶的水要每天換，每周瓶子還應(yīng)當(dāng)用異丙醇清洗一次。有的試驗(yàn)室則在水里加入0.1～1mM的甲酸抑制微生物的生長。這些做法看起來有些繁瑣，但卻能起到“磨刀不誤砍柴工”作用。

2、泵

接下來要沖洗的是泵。千萬不要一分析完沖幾分鐘后就停泵，特別是當(dāng)流動相中含有難揮發(fā)的緩沖液（如磷酸鹽）時。假如儀器不是連續(xù)使用，當(dāng)流動相蒸發(fā)時，難揮發(fā)物就會粘在活塞密封墊的表面，難揮發(fā)物將形成固形物沉淀。這是泵密封墊磨損和單向閥滲漏的緊要原因之一、所以，無論使用長短，在停泵以前確定要用非緩沖液流動相沖洗泵在半個小時以上，要是流動相中有難揮發(fā)緩沖鹽則建議沖洗的時間應(yīng)當(dāng)更長些。

3、自動進(jìn)樣器

自動進(jìn)樣器也要按規(guī)定清洗。現(xiàn)在的儀器多配有自動