(高清版)GBT 40138-2021 南方菜豆花葉病毒檢疫鑒定方法

ICSCCS65.020.01GB/T40138—2021南方菜豆花葉病毒檢疫鑒定方法國家市場監(jiān)督管理總局國家標準化管理委員會IGB/T40138—2021本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任。本文件由全國植物檢疫標準化技術委員會(SAC/TC271)提出并歸口。本文件起草單位：中國檢驗檢疫科學研究院、廣州1GB/T40138—2021南方菜豆花葉病毒檢疫鑒定方法1范圍本文件規(guī)定了南方菜豆花葉病毒的血清學和分子生物學檢測方法。本文件適用于豆科植物植株及種子中南方菜豆花葉病毒的檢疫鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法3術語和定義本文件沒有需要界定的術語和定義。4南方菜豆花葉病毒分類信息異名：菜豆花葉病毒4號Beanmosaicvirus4;南方菜豆花葉病毒1號Southernbeanmosaicvirus1;菜豆南方花葉病毒Beansouthernmosaicvirus分類地位：類南方菜豆花葉病毒目(Sobelivirales)南方菜豆一品紅花葉病毒科(Solemoviridae)南方菜豆花葉病毒屬(Sobemovirus)南方菜豆花葉病毒的其他信息見附錄A。5方法原理南方菜豆花葉病毒的血清學特性和基因組特征是該病毒檢疫鑒定的依據(jù)。根據(jù)南方菜豆花葉病毒與抗體之間的特異性反應，對植物樣品進行雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測定(DoubleAntibodySandwichEnzymeLinkedImmunosorbentAssay,DAS-ELISA);依據(jù)南方菜豆花葉病毒的基因組特征建立反轉(zhuǎn)錄重組酶聚合酶擴增技術(ReverseTranscriptionRecombinasePolymeraseAmplification,RT-RPA)和熒光RT-PCR檢測方法；通過這些方法的有效組合，判斷樣品是否帶有南方菜豆花葉病毒。除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純，實驗用水應符合GB/T6682中相關規(guī)定。2GB/T40138—2021DAS-ELISA試劑應符合附錄B中的B.1;RT-RPA試劑應符合附錄C中的C.1;熒光RT-PCR試劑應符合附錄D中的D.1。高速冷凍離心機：最大轉(zhuǎn)速15000r/min。微型瞬時離心機：最大轉(zhuǎn)速7000r/min。旋渦振蕩器：最大轉(zhuǎn)速為2800r/m高壓滅菌鍋：最大壓力為0.235MPa,可調(diào)控溫度范圍為105℃~135℃。紫外可見分光光度計：波長范圍為220nm～750nm,波長精度為1nm,分辨率為3nm。金屬?。簻囟确秶?℃~150℃,控溫精度±0.3℃。熒光PCR儀：溫度范圍4℃~100℃,溫度均一性±0.4℃。溫度范圍4℃~99℃。6.3用具待測樣品為植株小苗時，挑選有疑似癥狀的部位取樣，癥狀描述信息見附錄A;未表現(xiàn)癥狀的植株分組(10株為1組)編號，將采集的每組樣品分成3份，作為待檢樣品。待檢測樣品為種子時，挑選表皮皺縮、變小或有黑斑的種子；未表現(xiàn)癥狀種子分組(10粒為1組)編號，研磨成粉末，分成3份；在粉末中加入樣品抽提緩沖液(B.1.5),充分浸泡后離心取上清液作為待檢樣品。3GB/T40138—20217.3種子樣品種植制樣將種子播種于滅菌土中，待長出3片～4片真葉后進行檢測，取樣制樣同7.1。8檢測鑒定8.1DAS-ELISA測定把制備的樣品上清液加入已包被南方菜豆花葉病毒抗體的酶聯(lián)板中，進行DAS-ELISA檢測。每個樣品平行加到兩個孔中。健康的植物組織作為陰性對照，感染南方菜豆花葉病毒的植物組織作為陽性對照，樣品提取緩沖液作為空白對照；其中陰性對照的植物種類和材料(如葉片)應盡量與檢測樣品相一致。具體操作按照附錄B規(guī)定的方法進行。8.2RT-RPA檢測RT-RPA檢測陰性和陽性對照設置同8.1,滅菌雙蒸水(ddH?O)作為空白對照。分別提取樣品和對照的總RNA后進行RT-RPA檢測，具體操作按照附錄C規(guī)定的方法進行。8.3熒光RT-PCR檢測熒光RT-PCR檢測陰性和陽性對照設置同8.1,滅菌雙蒸水(ddH?O)作為空白對照。分別提取樣品和對照的總RNA后進行熒光RT-PCR檢測，具體操作按照附錄D規(guī)定的方法進行。9結果判定DAS-ELISA、RT-RPA和熒光RT-PCR中三種方法中任意兩種檢測方法的結果為陽性即可判定樣品攜帶南方菜豆花葉病毒。10結果記錄與樣品保存聯(lián)反應數(shù)值；RT-RPA檢測應有電泳圖片；熒光RT-PCR檢測應有擴增曲線圖。10.2樣品保存陽性樣品直接放于-80℃冰箱或冷凍干燥后放于-80℃冰箱，至少保存1年。保存的樣品要做好4GB/T40138—2021(資料性)南方菜豆花葉病毒其他信息A.1寄主范圍寄主范圍窄。除千日紅(Gomphrenaglobosa)外，只有豆科植物是易感寄主。能自然侵染菜豆(Phaseoluslunatus)和大豆(Glycinemax)等。A.2地理分布A.3癥狀菜豆(Phaseolusvulgaris):B株系和M株系引發(fā)局部褪綠斑或局部壞死，有些可系統(tǒng)侵染，有些不能系統(tǒng)侵染。菜豆上的系統(tǒng)侵染根據(jù)寄主的不同變種，其癥狀有輕重。輕者引起微弱花葉，重者造成嚴重花葉甚至新葉畸變。G株系通常誘發(fā)無癥狀表現(xiàn)的系統(tǒng)侵染(見圖A.1)。大豆(Glycinemax):許多株系可引起較弱的系統(tǒng)斑駁。棉豆(Phaseoluslunatus):B株系誘發(fā)產(chǎn)生小壞死斑。其他株系不敏感。綠豆(Vignaradiata):株系G引起局部小壞死斑，有些分離物引起系統(tǒng)花葉。豇豆(Vignaunguiculata):株系G在某些過敏品種引起局部枯斑。系統(tǒng)癥狀表現(xiàn)為明脈、花葉和畸葉。圖A.1南方菜豆花葉病毒侵染菜豆(左)和大豆(右)引起的癥狀A.4傳播途徑病毒可由葉甲傳播；菜豆種傳率為1%～5%,豇豆種傳率為5%～40%;實驗中易于機械接種傳播。A.5粒體形態(tài)病毒粒子為等軸對稱的二十面體(T=3),無包膜，直徑約為30nm,有180個蛋白亞基。5GB/T40138—2021基因組為ssRNA,全長約4136nt,編碼4個蛋白，分別編碼21kDa蛋白、105kDa蛋白(推測為聚合酶)、18kDa蛋白和30kDa蛋白個VPg,可能是侵染所必需的。6(規(guī)范性)雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測定(DAS-ELISA)B.1.1包被抗體特異性的南方菜豆花葉病毒抗體；宜使用商品化試劑盒抗體；4℃保存不超過1年；抗體使用時的稀釋比例按說明書要求稀釋。B.1.2酶標抗體堿性磷酸酯酶標記的南方菜豆花葉病毒抗體。對硝基苯磷酸二鈉(pNPP)。B.1.41×PBST緩沖液(pH7.4)氯化鈉(NaCl)磷酸二氫鉀(KH?PO?)磷酸氫二鈉(Na?HPO?)氯化鉀(KCl)吐溫-20(Tween-20)溶于900mL滅菌雙蒸水中，并定容至1000B.1.5樣品抽提緩沖液(pH7.4)亞硫酸鈉(Na?SO?)1.3g聚乙烯基吡咯烷酮(PVP,MW24000-40000)20.0g溶于900mL的1×PBST緩沖液中，并定容至1000mL,4℃儲存。B.1.6包被緩沖液(pH9.6)碳酸鈉(Na?CO?)碳酸氫鈉(NaHCO?)溶于900mL滅菌雙蒸水中，并定容至1000B.1.7酶標抗體稀釋緩沖液(pH7.4)牛血清白蛋白(BSA)聚乙烯基吡咯烷酮(PVP,MW24000-40000)溶于1000mL1×PBST緩沖液中，4℃儲存。7GB/T40138—2021B.1.8底物緩沖液(pH9.8)二乙醇胺97mL氯化鎂(MgCl?)0.1g疊氮鈉(NaN?)0.2g溶于800mL滅菌雙蒸水，用濃鹽酸(HCl)調(diào)pH至9.8,定容至1000mL,4℃儲存。B.2試驗步驟B.2.1包被抗體按要求的濃度和需要的體積用包被緩沖液稀釋包被抗體，每孔加100μL。酶聯(lián)板加蓋或用保鮮膜包好，37℃孵育2h。清空孔中溶液，用1×PBST緩沖液加滿各孔，3min后倒掉孔中溶液，在吸水紙上拍干。再重復2次上述洗板過程。B.2.2樣品制備與加樣按照1g待測樣品，5mL～10mL抽提緩沖液的比例，將待測樣品與抽提緩沖液混合，在研缽中研磨；3000r/min離心5min,上清液即為制備好的檢測樣品。陰性對照、陽性對照作相應處理或按說明書進行。按100μL/孔分別加入制備好的檢測樣品、陰性對照和陽性對照；酶聯(lián)板加蓋或用保鮮膜包好，4℃孵育過夜。酶聯(lián)板用水徹底沖洗，再用1×PBST緩沖液洗滌3次，每次3min。B.2.3加酶標抗體按說明將酶標抗體稀釋至工作濃度并加入酶聯(lián)板中，100μL/孔，酶聯(lián)板加蓋或用保鮮膜包好，37℃孵育4h。酶聯(lián)板用水徹底沖洗，再用1×PBST緩沖液洗滌3次，每次3min。B.2.4加底物B.2.5讀數(shù)在不同的時間內(nèi)如30min、60min、90min、120min或更長時間，用酶聯(lián)儀在405nm處讀OD值。B.3結果判定B.3.1質(zhì)量控制要求對照孔的OD?o5值(緩沖液孔、陰性對照及陽性對照孔)應在質(zhì)量控制范圍內(nèi)，即：緩沖液孔和陰性對照孔的OD??5值<0.15,當陰性對照孔的OD45值<0.05時，按0.05計算；陽性對照OD?o5值/陰性對照OD?5值>5;同一樣品的重復性基本一致。B.3.2結果判定在滿足B.3.1的質(zhì)量控制要求后，結果原則上可判斷如下：樣品OD?o?值/陰性對照OD?o5值>2,判為陽性；樣品OD4o?值/陰性對照OD?o?值為2時，判為可疑樣品，需重做一次或用RT-RPA或熒光RT-PCR驗證；樣品OD?05值/陰性對照OD?05值<2,判為陰性。若不滿足B.3.1的質(zhì)量控制要求，則不能進行結果判斷。GB/T40138—2021(規(guī)范性)C.1試劑C.1.1核酸提取及擴增試劑核酸提取試劑為Trizol或合格的RNA提取試劑盒。RT-RPA擴增試劑盒為TwistAmpBasicRTKits。三羥甲基氨基甲烷(Tris)242g冰乙酸(C?H?O?)57.1mL乙二胺四乙酸二鈉(Na?EDTA·2H?O)37.2g滅菌雙蒸水定容至1000mL,用時稀釋至1×TAE。C.2.1核酸提取RNA提取試劑盒進行操作。正向引物F:5'-TGGAAGCCCCGGCCACTCAATCGAGGAGGCCC-3';反向引物R:5'-ACTGTCACACCTCCAGCCGTTCTAAGCGATGGT-3'。擴增片段長度約169bp。C.2.3RT-RPA擴增2μL,醋酸鎂(280mmol/L)2.5μL,雙蒸水18GB/T40138—2021C.2.4產(chǎn)物檢測反應結束后向上述RT-RPA擴增產(chǎn)物中加入50μL苯酚/氯仿(1:1)溶液，充分混勻后12000r/min離心2min,取5pL上清液按比例與電泳上樣緩沖液混勻，用DNAMarker作為分子量標記，在1.5%的瓊脂糖凝膠中進行電泳。電泳結束后在凝膠成像儀中觀察是否擴增出預期的特異性DNA片段，并拍攝記錄。C.3結果判定如果陰性對照和空白對照未出現(xiàn)片段，陽性對照出現(xiàn)預期169bp的片段，樣品未出現(xiàn)預期大小的如果陰性對照和空白對照未出現(xiàn)片段，陽性對照出現(xiàn)預期169bp的片段，樣品出現(xiàn)預期大小的片段，判定樣品為南方菜豆花葉病毒。可通過序列測定和BLAST分析對PCR產(chǎn)物進一步確認，確認為南方菜豆花葉病毒的序列相似性為≥95%。9GB/T40138—2021(規(guī)范性)熒光RT-PCRD.1試劑核酸提取試劑同C.1.1。D.2引物探針熒光RT-PCR所用引物探針如表D.1。表D.1引物探針序列引物探針名稱引物探針序列(5'-3′FPTTCCAATATGATATGGCTGACACFP1TGACTCATTGGCCTATATTGGAA-PCCAGAGGATCCAGACCAGA