酶學及酶工程

關(guān)于酶學及酶工程第二章酶的結(jié)構(gòu)與功能第三節(jié)酶的活性部位及催化機理第2頁,共33頁，星期六，2024年，5月一、酶的活性部位模型假說1.鎖鑰模型假說鎖鑰模型假說提出了酶作為生物催化劑有一個重要特點，即實現(xiàn)催化的必要條件是底物必須在酶上特異性結(jié)合。酶上存在特定的結(jié)合部位，結(jié)合部位與底物之間存在互補的特點，就像鎖和鑰匙的關(guān)系，因而造成酶催化反應(yīng)的很強的專一性。結(jié)合部位是酶的活性中心的組成部分。第3頁,共33頁，星期六，2024年，5月底物在活性部位的結(jié)合力底物和結(jié)合部位有形狀的配合，使底物的原子與結(jié)合部位的原子有盡可能多的接近到范德華半徑內(nèi)。除范德華力，穩(wěn)定底物結(jié)合的力還有離子間引力、氫鍵和疏水作用，側(cè)鏈、輔基和底物之間存在相應(yīng)的配合。按鎖鑰模型假說，酶的活性中心空間結(jié)構(gòu)是剛性的。第4頁,共33頁，星期六，2024年，5月2.誘導(dǎo)契合模型假說后來的研究發(fā)現(xiàn)自由酶的活性部位和底物間并不精確地像鎖鑰匙一般配合，從而提出了誘導(dǎo)契合模型假說。該假說認為，酶與底物結(jié)合時，結(jié)合力促使酶和底物分別發(fā)生一些構(gòu)象的變化，從而更有利于催化反應(yīng)的發(fā)生。構(gòu)象變化使活性部位和底物達到精確配合，結(jié)合更緊密，并使催化基團處于更有利于催化的位置上。底物形變造成應(yīng)力狀態(tài)會使發(fā)生反應(yīng)的鍵變?nèi)酰档头磻?yīng)的活化自由能，使反應(yīng)速度增加。形變所需的能量則是由結(jié)合能提供的。

第5頁,共33頁，星期六，2024年，5月誘導(dǎo)契合示意圖底物誘導(dǎo)酶活性部位發(fā)生形變，反作用力使底物也相應(yīng)形變，達到底物和活性部位完全契合。誘導(dǎo)契合模型是目前酶學界的主流認識。第6頁,共33頁，星期六，2024年，5月誘導(dǎo)契合—鎖鑰新模型探索蚯蚓蛋白酶I有三種蛋白酶活性：凝血酶Th，胰凝乳蛋白酶Ch，尿激酶U。發(fā)現(xiàn)該酶作用Th或Ch底物后，U活性下降。但與U底物作用后不影響Th和Ch活性。而Th和Ch底物剛性，U底物相對柔性?！猂.Panetal.JBC,2010；第7頁,共33頁，星期六，2024年，5月該酶活性部位含有熒光基團。測定表明該酶與Th或Ch底物結(jié)合后內(nèi)源熒光有較大變化，但和U底物結(jié)合后變化不大。用低濃度胍擾動該酶活性部位也造成熒光變化，但結(jié)合過Th或Ch底物后再用胍擾動熒光變化不大了。用蚯蚓蛋白酶II、枯草桿菌蛋白酶、乳酸脫氫酶也能得到類似的結(jié)果。表明這些酶活性部位有較大構(gòu)象變化后會維持該構(gòu)象,再作用按鎖鑰模型,形成先誘導(dǎo)契合再鎖鑰的機制。有無普遍性還需證明?！獜堊咏。┦空撐?，2013第8頁,共33頁，星期六，2024年，5月二、活性部位的催化理論1.活性部位的組成按功能，酶的活性部位包含底物結(jié)合部位和催化基團兩部分。底物在酶上的結(jié)合可有效地降低反應(yīng)所需的自由能，是酶反應(yīng)的必要基礎(chǔ)。降低反應(yīng)自由能的因素包括鄰近效應(yīng)，定向效應(yīng)和形變效應(yīng)。

催化基團實施具體的催化反應(yīng)。如酸堿催化，共價催化。第9頁,共33頁，星期六，2024年，5月活性部位的組成成分形成活性部位的組成成分包括主鏈結(jié)構(gòu)，側(cè)鏈基團和輔基。主鏈形成活性部位的基礎(chǔ)形狀。側(cè)鏈基團完成活性部位的構(gòu)成，是活性部位的主要成分。很多酶還包含金屬或有機輔基，它們雖不是肽鏈的一部分，但緊密結(jié)合在酶分子中，并實際參與了活性部位的形成，有的是結(jié)合部位的一部分，有的本身是催化基團，還有的能夠傳遞中間產(chǎn)物。第10頁,共33頁，星期六，2024年，5月2.酶催化的熱力學原理過渡態(tài)和活化能化學反應(yīng)通過過渡態(tài)完成，形成過渡態(tài)需要活化自由能。酶促進過渡態(tài)形成，并和過渡態(tài)結(jié)合更緊密。因此過渡態(tài)類似物往往是優(yōu)良的專一性抑制劑。第11頁,共33頁，星期六，2024年，5月活化自由能非催化反應(yīng)的活化能高，反應(yīng)不易進行，速度慢。與酶結(jié)合成復(fù)合物時底物變?yōu)檫^渡態(tài)，結(jié)合能提供了所需的活化能。由復(fù)合物進行反應(yīng)所需要的活化能就少了。酶的催化功能主要是由于降低了反應(yīng)活化能，從而提高了反應(yīng)速度。k=(kbT/h)e–ΔG/RT第12頁,共33頁，星期六，2024年，5月酶降低活化自由能的方式

ΔG=ΔH–TΔS1）熵因素：底物結(jié)合于酶使其自由度減少，ΔS是負值而增加系統(tǒng)自由能，據(jù)計算常溫下反應(yīng)所需活化自由能約一半是熵因素貢獻的。底物在酶上結(jié)合時，存在臨近效應(yīng)和定向效應(yīng)，使系統(tǒng)自由度減少，因此形成復(fù)合物時熵減少?；罨杂赡苤械撵匾蛩卦诖诵?yīng)中實現(xiàn)，其后進行反應(yīng)時所需的活化自由能就減少了。第13頁,共33頁，星期六，2024年，5月鄰近效應(yīng)和定向效應(yīng)

底物之間及底物對活性部位的鄰近和定向增加了有序性，減小了自由度，從而降低了系統(tǒng)的熵，而增加了系統(tǒng)的自由能。雙分子反應(yīng)兩個底物在結(jié)合部位定向結(jié)合并彼此靠近，比溶液中發(fā)生反應(yīng)的可能性高得多，相當于大大提高了反應(yīng)物濃度。所有酶反應(yīng)底物和酶之間都有反應(yīng)所需的相互作用，定向和鄰近使反應(yīng)加快。底物結(jié)合時墑減少所需要的自由能由底物結(jié)合時放能提供。第14頁,共33頁，星期六，2024年，5月結(jié)合能第15頁,共33頁，星期六，2024年，5月鄰近效應(yīng)和定向效應(yīng)例子羧基和酯基間可反應(yīng)生成酸酐。二羧酸單苯酯的的反應(yīng)比雙分子羧酸和酯的反應(yīng)速度快得多，表現(xiàn)了鄰近效應(yīng)和定向效應(yīng)。第16頁,共33頁，星期六，2024年，5月而羧基和酯之間自由度越少，鄰近效應(yīng)和定向效應(yīng)越強，反應(yīng)速度越快。

作用物反應(yīng)速度第17頁,共33頁，星期六，2024年，5月2）焓因素：形變效應(yīng)誘導(dǎo)契合使底物在活性部位結(jié)合時出現(xiàn)形變，造成底物分子內(nèi)應(yīng)力，相關(guān)鍵變?nèi)酢τ诹姿狨ニ夥磻?yīng)，有形變應(yīng)力的環(huán)狀磷酸酯水解比無應(yīng)力的開環(huán)磷酸酯快108倍，表現(xiàn)了底物形變對反應(yīng)速度的影響。第18頁,共33頁，星期六，2024年，5月形變效應(yīng)熱力學鍵的形變需要吸收一定能量ΔH，自由能增加。所需能量也由底物在酶上的結(jié)合能提供。其后進行反應(yīng)時所需的活化自由能就減少了，這使反應(yīng)速度加快。第19頁,共33頁，星期六，2024年，5月三、酶催化的化學機制1.酸堿催化：酸催化第20頁,共33頁，星期六，2024年，5月堿催化酸堿催化的特點是由廣義酸或堿（質(zhì)子提供者或接受者）啟動，催化反應(yīng)通過質(zhì)子和電子的轉(zhuǎn)移而實現(xiàn)。酸堿催化可使反應(yīng)速度提高2到5個數(shù)量級。第21頁,共33頁，星期六，2024年，5月酶分子中的質(zhì)子供體和受體

質(zhì)子供體質(zhì)子受體

-COOH-COO--NH3+-NH2-SH-S--OH-O-第22頁,共33頁，星期六，2024年，5月2.共價催化催化反應(yīng)中，酶的催化基團和底物形成臨時共價鍵，使底物被激活為中間態(tài)，進而實現(xiàn)被催化的反應(yīng)而生成產(chǎn)物，同時酶恢復(fù)游離態(tài)：這種催化機制稱為共價催化。共價催化包括親核催化和親電催化。第23頁,共33頁，星期六，2024年，5月親核催化和親電催化如酶分子富含可提供公用電子對的親核基團，如氨基、巰基、羥基、咪唑基等，其提供電子對給帶部分正電的底物而形成臨時共價鍵，這種催化作用就是親核催化。由于酶的側(cè)鏈基團大多是親核的，親核催化是共價催化中的主要形式。如酶分子含有缺少電子的親電基團，與富含未公用電子對的底物形成臨時共價鍵而完成催化反應(yīng)的稱為親電催化。第24頁,共33頁，星期六，2024年，5月親核催化例第25頁,共33頁，星期六，2024年，5月四、酶的輔因子很多酶有輔因子，包括和酶牢固結(jié)合的輔基以及不牢固結(jié)合的輔酶。輔因子包括金屬輔因子和有機輔因子兩類。最常見的輔酶包括NAD，NADP，CoA，核苷二磷酸或三磷酸和磷酸吡哆醛等，可以把它們歸于底物一類中。而輔基則可以看做是酶的一部分，一般均結(jié)合在活性中心，成為活性中心的組成部分。第26頁,共33頁，星期六，2024年，5月1.金屬輔因子已知酶中大約有三分之一以上需要金屬離子。含金屬輔基的稱為金屬酶。有些酶和金屬離子結(jié)合不緊密，純化時失去金屬離子，但需加入金屬離子才有活性，稱為金屬激活酶。此時金屬離子應(yīng)是金屬輔酶。

金屬離子參與酶的催化作用的方式有多種：1）接受或提供電子，或做為親電劑或親核劑,或激活親電劑或親核劑；2）通過配位鍵結(jié)合底物，并引起底物形變；3）保持反應(yīng)基團的三維取向，穩(wěn)定酶活性部位于活性構(gòu)象。第27頁,共33頁，星期六，2024年，5月過渡金屬酶

過渡金屬酶往往通過多配價鍵結(jié)合，結(jié)合很緊密，一般形成金屬酶。較多見的金屬離子包括鋅、銅、鉬、鐵、鈷等。羧肽酶A是一個典型含鋅金屬酶?；钚灾行挠幸粋€含鋅而結(jié)合C末端的疏水口袋。

第28頁,共33頁，星期六，2024年，5月羧肽酶AZn2＋位于該酶活性中心，和His69，Glu72，His196以及水以配位鍵結(jié)合。底物C末端與Arg145側(cè)鍵通過靜電吸引，使底物定位。Zn2＋通過吸電子作用促進肽鍵水解。

第29頁,共33頁，星期六，2024年，5月2.有機輔基

生物素可共價結(jié)合羧基。它通過酰胺鍵和蛋白質(zhì)的賴氨酸側(cè)鏈氨基結(jié)合，形成生物素羧基載體蛋白。（BCCP）第30頁,共33頁，星期六，2024年，5月乙酰輔酶A羧化酶因BCCP能和羧基鍵合，在羧化