醋酸薄膜電泳

關于醋酸薄膜電泳1、掌握電泳法分離蛋白質(zhì)的原理2、熟悉醋酸纖維素薄膜電泳的操作、注意事項3、熟悉測定血清中各種蛋白質(zhì)相對百分含量的方法4、了解A\G的臨床意義實驗目的第2頁,共33頁，星期六，2024年，5月分離蛋白質(zhì)的方法分離方法沉淀法鹽析法有機溶劑沉淀法層析法電學法電泳法等電聚焦超速離心法離子交換層析吸附層析凝膠過濾（分子篩）親和層析第3頁,共33頁，星期六，2024年，5月電泳

依據(jù)分子或顆粒所帶電荷、形狀、大小等不同，因而在電場介質(zhì)中移動速度不同，從而達到分離的技術。

一、電泳第4頁,共33頁，星期六，2024年，5月H＋OH－H＋OH－pH>pIpH=pIpH<pI

陰離子，向正極移動陽離子，向負極移動第5頁,共33頁，星期六，2024年，5月電泳速度:帶電粒子在電場中運動時，單位電場強度內(nèi)粒子運動的速度，以u表示，即

V—粒子運動的速度X—電場強度Q—粒子所帶電荷r—粒子的半徑η—介質(zhì)的粘度第6頁,共33頁，星期六，2024年，5月二、電泳的影響因素

分離樣品的性質(zhì)電泳介質(zhì)的pH

緩沖液的離子強度電場強度電滲作用第7頁,共33頁，星期六，2024年，5月電滲作用

在電場中液體對固體支持物的相對移動.如果樣品原本是移向負極的，則泳動的速度加快；如果樣品原本是移向正極的，則泳動的速度減慢。

負極正極－－－－－－－－表面帶負電荷帶正電荷的水層攜帶粒子向負極移動

＋＋＋＋＋＋＋＋第8頁,共33頁，星期六，2024年，5月三、電泳的分類支持介質(zhì)不同紙電泳（Paperelectrophorisis）醋酸纖維薄膜電泳（CelluloseAcetateelectrophoresis）瓊脂凝膠電泳（AgarGelelectrophoresis）聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）第9頁,共33頁，星期六，2024年，5月支持介質(zhì)裝置形式不同：⑴平板式電泳；

⑵垂直板式電泳；

⑶垂直柱式電泳pH的連續(xù)性不同：

連續(xù)pH電泳非連續(xù)pH電泳第10頁,共33頁，星期六，2024年，5月血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳Celluloseacetatemembraneelectrophoresisofserumproteins第11頁,共33頁，星期六，2024年，5月

本實驗以醋酸纖維膜為電泳支持物，分離各種血清蛋白。醋酸纖維膜是由醋酸纖維加工制成的一種細密且薄的微孔膜。廣泛應用于醫(yī)學臨床中各種生物分子的分離分析中。實驗原理第12頁,共33頁，星期六，2024年，5月醋酸纖維素較紙電泳的優(yōu)點電滲作用影響小醋酸纖維素膜對蛋白的吸附小，幾乎無“拖尾”。由于醋酸纖維素親水性小，所容納的緩沖液也較少，電流大部分是由樣品傳導，所以分離速度快。醋酸纖維素是纖維素（紙）的醋酸酯第13頁,共33頁，星期六，2024年，5月血清蛋白質(zhì)

清蛋白和球蛋白

清蛋白和α1、α2、β、γ-球蛋白電泳第14頁,共33頁，星期六，2024年，5月

血清蛋白的等電點pI大多在7.5以下，在pH為8.6的巴比妥緩沖液中以負離子形式存在，并且蛋白質(zhì)的分子量、立體構象、等電點及形狀也有差異，在電場中遷移速率不同，可以在醋酸纖維素薄膜上分離成清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白、r球蛋白五個區(qū)帶。預測電泳譜是什么樣？第15頁,共33頁，星期六，2024年，5月血清蛋白電泳的正常組分

第16頁,共33頁，星期六，2024年，5月醋酸纖維膜電泳蛋白組分變化的臨床意義（A/G）

可能相關疾病清蛋白α1球蛋白α2球蛋白β球蛋白γ球蛋白骨髓瘤↑*腎病綜合癥↓↑*↑*腎炎↑*↑肝硬化↓↑*急性肝壞死↓*↑↑↑↑傳染性肝炎↓↑*↑*急性感染初期↑*↑*↑*慢性炎癥/感染后期↑*低

球蛋白血癥↓*第17頁,共33頁，星期六，2024年，5月

實驗步驟一、準備與點樣醋酸纖維薄膜電泳裝置示意圖1、濾紙橋；2、電泳槽；3、醋酸纖維素薄膜；4、電泳槽膜支架；5、電極室中央隔板第18頁,共33頁，星期六，2024年，5月鑷子取出膜條取一條2.5×8cm的膜條充分浸透在巴比妥緩沖液中濾紙吸去多余的緩沖液無光面距一端1.5cm（大拇指寬）處作點樣線點樣器下端粘上薄層血清垂直點樣

加樣時一定要呈直線，垂直分布均勻，這樣泳動的區(qū)帶整齊不歪。第19頁,共33頁，星期六，2024年，5月放置膜條平衡5分鐘通電關閉電源點樣面向下點樣端置于陰極膜條貼緊濾紙，拉直膜條電壓：120v/160v時間：10min/50min二、電泳點樣線勿與濾紙橋接觸

通電后，不要用手或鑷子接觸電泳槽，通電完畢，先切斷電源，以防觸電。第20頁,共33頁，星期六，2024年，5月第21頁,共33頁，星期六，2024年，5月通電完畢浸于染色液（氨基黑10B）中取出膜條三、染色、脫色取出膜條3min依次浸于漂洗液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ濾紙吸干薄膜各5min直至漂凈第22頁,共33頁，星期六，2024年，5月白蛋白α1球蛋白β球蛋白α2球蛋白點樣線Γ球蛋白第23頁,共33頁，星期六，2024年，5月取試管6支，編號如下四、定量(兩人的膜條共用)

試管編號

Aα1α2βγ00.4mol/LNaOH

6.0ml3.0ml3.0ml3.0ml3.0ml3.0ml蛋白條帶清蛋白α1球蛋白α2球蛋白β球蛋白γ球蛋白無蛋白區(qū)

充分振蕩、脫凈染料比色650nm、定量15min第24頁,共33頁，星期六，2024年，5月

原始數(shù)據(jù)：清蛋白α1球蛋白α2球蛋白β球蛋白γ球蛋白A

表1血清各蛋白質(zhì)吸光值儀器型號：吸收波長：實驗時間：第25頁,共33頁，星期六，2024年，5月實驗結果

1．計算出各部分蛋白質(zhì)占總蛋白質(zhì)的百分數(shù)。

清蛋白％＝（2A/∑T）×100％ α1球蛋白％＝（α1/∑T）×100％ α2球蛋白％＝（α2/∑T）×100％ β球蛋白％＝（β/∑T）×100％ γ球蛋白％＝（γ/∑T）×100％光密度總和T＝2A+α1＋α2

＋β＋γ2．計算出清蛋白與球蛋白之比值（A/G）

G=α1＋α2＋β＋γ第26頁,共33頁，星期六，2024年，5月注意事項1.點樣面為不光滑面，勿用手觸摸感知；2.點樣量適中，垂直點樣；3.點樣端接電泳儀負極；4.膜條與濾紙需貼緊，拉直；5.謹防觸電。第27頁,共33頁，星期六，2024年，5月1、電泳時，點樣端置于電場的正極還是負極？為什么？2、電泳后，泳動在最前面的是何種蛋白質(zhì)？各譜帶為何種成分？請分析原因。3、電泳圖譜清晰的關鍵是什么？如何正確操作？實驗思考討論第28頁,共33頁，星期六，2024年，5月1.蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)？2.蛋白質(zhì)的鹽析？3.蛋白質(zhì)的顯色反應有哪些？4.分離蛋白質(zhì)的方法有哪些？5.層析技術的分類及各自的原理。6.透析的原理？實驗四血清γ-球蛋白的提純第29頁,共33頁，星期六，2024年，5月第30頁,共33頁，星期六，2024年，5月待分離大分子的性質(zhì)

所帶的電荷、分子大小和形狀。分子帶的電荷量越大、直徑越小、形狀越接近球形，則其電泳遷移速度越快。

pH值距離其等電點愈遠，其所帶凈電荷量就越大，電泳的速度也就越大。pH過高或過低會引起蛋白質(zhì)變性。電泳介質(zhì)的pH第31頁,共33頁，星期六，2024年，5月緩沖