T-SHAAV 014-2024 動物病原微生物基因擴增實驗室技術要求

ICS11.220B42SHAAV團體標準T/SHAAV014—2024動物病原微生物基因擴增實驗室技術要求LaboratorytechnicalrequirementsforgeneamplificationofanimalpathogeniCmicroorganisms2024-04-10發(fā)布2024-04-10實施上海市畜牧獸醫(yī)學會發(fā)布T/SHAAV0142024前言本文件按照GB/T1.12020《標準化工作導則第1部分:標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任。本文件由上海市畜牧獸醫(yī)學會提出并歸口。本文件起草單位:上海市動物疫病預防控制中心、上海市奉賢區(qū)生態(tài)養(yǎng)殖服務中心、上海市嘉定區(qū)農業(yè)技術推廣服務中心、上海市松江區(qū)農產品質量安全中心、上海祥欣畜禽有限公司、上海松林食品(集團)有限公司。本文件主要起草人:鞠厚斌、楊德全、王建、李鑫、趙洪進、陳琦、盛文偉、吳文輝、陶軍、金一春、李布社、莊根平、楊顯超、王曉旭、葛菲菲、沈海瀟、周錦萍、李凱航、曹向英、石慧花、葛杰、李曉婕、唐燕婷。本文件首批承諾執(zhí)行單位名單:上海市動物疫病預防控制中心、上海市奉賢區(qū)生態(tài)養(yǎng)殖服務中心、上海市嘉定區(qū)農業(yè)技術推廣服務中心、上海市松江區(qū)農產品質量安全中心、上海祥欣畜禽有限公司、上海松林食品(集團)有限公司。T/SHAAV0142024動物病原微生物基因擴增實驗室技術要求本文件規(guī)定了動物病原微生物基因擴增實驗室總體要求、質量保證和質量控制。本文件適用于動物病原微生物基因擴增實驗室的布局設置及開展基因擴增檢測活動。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中,注日期的引用文件,僅該日期對應的版本適用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB19489實驗室生物安全通用要求GB/T19495.2轉基因產品檢測實驗室技術要求GB/T27025檢測和校準實驗室能力的通用要求GB/T27403實驗室質量控制規(guī)范食品分子生物學檢測GB/T40974核酸樣本質量評價方法CNAS-CLO1檢測和校準實驗室能力認可準則CNAS-CL01-A024檢測和校準實驗室能力認可準則在基因擴增檢測領域的應用說明CNAS-GL029基因擴增領域檢測實驗室認可指南NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術規(guī)范JJF1527聚合酶鏈反應分析儀校準規(guī)范JJF1815II級生物安全柜校準規(guī)范JJG646移液器檢定規(guī)程3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。基因擴增geneamplification通過生物體外試驗的方法為某一特定的基因的拷貝數選擇性地增加而其它基因并未按比例增加的過程(不包括自然基因擴增),即以擴增檢測DNA或RNA為方法的檢測技術。[來源:CNAS-CL01-A024,3]聚合酶鏈反應polymerasechainreaction,PCR體外擴增DNA的酶促反應過程。[來源:SNiT2102.12008,3.4.1]反轉錄聚合酶鏈反應reversetranscriptasepolymerasechainreaction,RT-PCR包括RNA反轉錄為DNA和PCR擴增兩步反應。[來源:SNiT2102.12008,3.4.23.42T/SHAAV0142024實時熒光PCRreal-timePCR通過在PCR反應體系中加入熒光標記探針,利用熒光信號累積實現對PCR擴增效率、擴增情況及數據進行實時監(jiān)控的PCR方法。[來源:農業(yè)部2259號公告4215,2.7]4縮略語下列縮略語適用于本文件。DNA:脫氧核糖核酸(Deoxyribonucleicacid)EB:溴化乙錠(Ethidiumbromide)EDTA:乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraaceticacid)GITC:異硫氰酸胍(Guanidinethiocyanate)PCR:聚合酶鏈式反應(polymerasechainreaction)RNA:核糖核酸(Ribonucleicacid)5動物病原微生物基因擴增實驗室的分區(qū)要求5.1.1設施和環(huán)境要求動物病原微生物基因擴增實驗室設計和布局應符合相關法律法規(guī)的要求,設施與環(huán)境應符合GB19489、GB/T27025、CNAS-CLO1、CNAS-CL01-A024和CNAS-GL029中的規(guī)定。動物病原微生物基因擴增實驗室,總體布局和各部位的安排應減少潛在的對樣本的污染和對人員的危害,原則上應設分隔開的工作區(qū)域,包括(但不限于):試劑配制與貯存區(qū)、核酸提取區(qū)、核酸擴增區(qū)和擴增產物分析區(qū)。有條件的宜在所分隔的各工作區(qū)域設置緩沖間,緩沖間的壓力為負壓,與其相連的工作間為正壓,工作間與緩沖間之間宜安裝磁性連鎖裝置。未設置緩沖間的工作區(qū)域的壓力設計一般遵循試劑配制與貯存區(qū)為正壓,其它三個工作區(qū)域為負壓或減壓的原則。根據儀器設備的配置及功能,區(qū)域可適當合并。如使用熒光定量PCR儀時,核酸擴增區(qū)、擴增產物分析區(qū)可進行合并;采用樣本處理、核酸提取及擴增檢測為一體的自動化分析儀,則核酸提取區(qū)、核酸擴增區(qū)、擴增產物分析區(qū)可進行合并。不同功能的工作區(qū)域應是分隔獨立的工作室,并有明顯的標志,各區(qū)間不能直通,各區(qū)之間如果是緊密相連,需安裝物品傳遞艙。動物病原微生物基因擴增實驗室的空氣流向可按照試劑配制與貯存區(qū)核酸提取區(qū)→核酸擴增區(qū)→擴增產物分析區(qū)進行,防止擴增產物順空氣氣流進入擴增前的區(qū)域。可按照從試劑配制與貯存區(qū)核酸提取區(qū)→核酸擴增區(qū)→擴增產物分析區(qū)方向空氣壓力遞減的方式進行。可安裝排風扇,負壓排風扇裝置和其它可行的方式實現。5.2實驗室工作區(qū)域的設置及要求用于試劑的配制和貯存(包括商業(yè)化的試劑),所有試劑的配制與分裝。壓力可設置為正壓。5.2.2核酸提取區(qū)用于樣本的前處理,核酸的提取、純化與貯存,核酸提取質量檢查等。樣本前處理所用器皿應經過徹底清洗和高壓消毒處理,并單獨使用。用過的器皿應采取措施消除核酸的污染,否則不可重復使用。對于涉及臨床樣本的操作,應符合生物安全二級實驗室防護設備、個人防護和操作規(guī)范的要求。應防范病原微生物外泄和污染人員,保護樣本不被污染,應配備II級生物安全柜。壓力可設置為常壓或負壓,可安裝排風系統(tǒng)。3T/SHAAV01420245.2.3核酸擴增區(qū)用于擴增反應體系的配制和模板的加入,核酸擴增。在巢式PCR測定中,第一輪擴增后需打開反應管,第二次加樣必須在本區(qū)內進行。壓力可設置為負壓,可按-20pa(緩沖間為常壓)設置,可安裝排風系統(tǒng)。5.2.4擴增產物分析區(qū)用于擴增產物的檢測和確認。壓力可設置為負壓,可安裝排風系統(tǒng)。5.3工作基本原則5.3.1進入各工作區(qū)域應嚴格按照單一方向進行,即試劑配制與貯存區(qū)核酸提取區(qū)→核酸擴增區(qū)產物分析區(qū)。5.3.2各工作區(qū)域應有明確的標識,不同工作區(qū)域內的設備、物品不得混用。5.3.3在不同的工作區(qū)域應使用有明顯區(qū)別標志的工作服,以便于鑒別。當工作者離開工作區(qū)時,不得將各區(qū)特定的工作服帶出。5.3.4實驗室的清潔應按試劑配制與貯存區(qū)至擴增產物分析區(qū)的方向進行。不同的實驗區(qū)域應有其各自的清潔用具,不得混用,以防止交叉污染。5.3.5工作者在整個實驗操作過程中應戴口罩和手套,并及時更換。5.3.6在操作過程中應正確使用移液器,避免在移液操作中產生氣溶膠污染。5.3.7在樣本前處理、核酸提取等過程中出現實驗材料散落或PCR產物外濺時,應立即進行清潔處理并作出記錄。5.3.8實驗結束后,應立即對工作區(qū)域進行清潔。實驗臺面、超凈工作臺宜用3%雙氧水或10%次氯酸鈉溶液(含有效氯1gL)擦拭清潔;也可在擦拭后再用紫外線照射,照射距離應不超過90cm,照射時間宜過夜。注:3%雙氧水和10%次氯酸鈉在使用前配制,配制好的溶液不宜長期存放。5.3.9實驗室及其設備的使用應做好日常記錄。5.4安全防護工作者在整個實驗操作過程中應戴手套、口罩、帽子,且應根據病原微生物的類別,佩戴防護眼鏡、穿防護服或采取其他安全有效措施,應按照GB19489中的規(guī)定執(zhí)行。5.5廢物處置5.5.1感染性材料所有感染性材料應在實驗室內通過高壓滅菌等方式清除污染再進行處置,按照GB19489中的規(guī)定執(zhí)行。5.5.2移液器吸頭使用過的移液器吸頭應放入含有10%次氯酸鈉溶液的容器內浸泡,浸泡時間不宜少于24h。5.5.3PCR產物和陽性質粒含有PCR產物的所有液體及廢棄物和陽性質粒應放入含有1mol/L鹽酸(HCL)的容器中浸泡,浸泡時間不少于6h5.5.4瓊脂糖凝膠及電泳液對含有EB或經EB浸泡過的瓊脂糖凝膠、電泳緩沖液的處理按照GB/T19495.2中的規(guī)定執(zhí)行。6質量保證6.1.1樣本的采集按NY/T541執(zhí)行。用于基因擴增檢測的樣本包括內臟組織,抗凝全血、血清,糞、尿及分泌物等。進行靜脈采血時,宜使用專用的一次性安全真空采血器。進行臟組織、糞、尿、分泌物4T/SHAAV0142024等的采樣時,應注意防止交叉污染。6.1.2在某一疫病的病程中,樣本采集過早或過遲都會導致假陽性或假陰性結果,應注意樣本采集時限性或時效性。6.1.3樣本的采集材料(如拭子)或試劑(如抗凝劑、防腐劑或其他常規(guī)添加劑)應不干擾擴增或檢測過程,抗凝劑應選取EDTA或構櫞酸鹽。6.1.4全血樣本應進行抗凝處理,采血后,應在3h內分離血漿。6.1.5無需抗凝處理的血液樣本,采血后,應在1h內分離血清,以避免RNA的降解。6.2樣本的穩(wěn)定化處理6.2.1用于DNA擴增檢測的樣本,不需穩(wěn)定化處理,應在采集后冷藏條件下及時送至實驗室。6.2.2用于RNA擴增檢測的樣本,需穩(wěn)定化處理,應在采集樣本時,將樣本材料如血清或血漿按1:4的比例加至含有5mol/LGrTC的試管中,從而使血清(漿)中的RNA酶不可逆失活。6.3樣本的運送樣本采集后應盡快送至實驗室進行檢測,運輸過程中,特別是在需要保持細胞的完整性時,應注意避免樣本的過冷或過熱,并盡量減少細菌等污染物的生長,而且應保證樣本中的靶核酸免受內源性或外源性核酸酶的破壞與降解。6.4樣本的貯存6.4.1采集的臨床樣本可于-70℃以下長時間貯存。6.4.2用于PCR測定的DNA靶核酸樣本應在10mmol/LTris-1mmolLEDTA緩沖液(PH7.5~8.0)中4℃保存。6.4.3用于PCR測定的RNA靶核酸樣本應在一定緩沖液中-80℃或液氮中貯存。6.4.4用乙醇或異丙醇等沉淀的靶核酸樣本貯存在-20℃即可。6.4.5用GITC處理的RNA樣本可在室溫保存7d。6.5樣本的處理6.5.1樣本的處理應盡量簡化,以減少樣本的交叉污染或丟失靶核酸的機會。6.5.2待擴增的靶核酸可能來源于不同的臨床樣品,如血液、體液、糞便、組織等。靶核酸可有不同的存在形式和存在部位。應根據靶核酸不同的存在狀態(tài),采取相應的處理方法,選取相應的商品化核酸提取試劑盒。6.5.3核酸樣本的濃度、純度和完整性的質量評價方法見GBT40974。6.6逆轉錄CDNA合成為逆轉錄PCR中的第一個酶反應步驟,應避免逆轉錄效率的降低或完全缺乏;樣本中避免存在逆轉錄或Taq酶的抑制物(如酚、氯仿、血紅素等)及RNA酶的存在。6.7核酸擴增多種因素可引起核酸擴增檢測的假陽性或假陰性結果,如擴增靶核酸中抑制劑存在、Taq酶失活、退火溫度不當、Mg2+濃度不佳、樣本或試劑受污染等。6.8擴增產物的分析6.8.1擴增產物的分析方法有多種,如瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、限制性酶切、斑點印跡、探針雜交、測序、分光光度法定量等。擴增產物是主要的污染來源,應避免通過物品及工作服將擴增產物帶出。6.8.2使用過的移液器吸頭、PCR產物和含有EB或經EB浸泡過的瓊脂糖凝膠、電泳緩沖液分別按本文件中5.5.2、5.5.3和5.5.4中規(guī)定處理。6.8.3在用到某些可致基因突變和有毒物質如EB、丙烯酰胺、甲醛或放射性核素等,應注意工作人員的安全防護。5T/SHAAV01420246.9污染的分析與處理檢測過程中對污染的預防和處理原則,防止交叉污染的措施按照GB/T27403和GB/T19495.2中的規(guī)定執(zhí)