PCR核酸擴(kuò)增儀(部編)課件

分子生物學(xué)相關(guān)儀器檢驗(yàn)學(xué)院李平法PCR基因擴(kuò)增儀DNA測序儀

核酸雜交儀

中心法則轉(zhuǎn)錄翻譯逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制DNARNA蛋白質(zhì)

一、分子生物學(xué)核心內(nèi)容前言生物樣品DNA片段基因診斷基因治療基因工程產(chǎn)品法醫(yī)學(xué)檢測人類學(xué)研究……二、分子生物學(xué)的應(yīng)用前言生物樣品DNA片段基因工程核酸雜交基因擴(kuò)增基因測序表達(dá)調(diào)控……三、分子生物學(xué)的核心技術(shù)前言第二節(jié)PCR核酸擴(kuò)增儀原理和應(yīng)用內(nèi)容提要PCR核酸擴(kuò)增儀的工作原理

PCR技術(shù)的原理及發(fā)展PCR基因擴(kuò)增儀的工作原理PCR擴(kuò)增儀的分類與結(jié)構(gòu)

定性PCR擴(kuò)增儀實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀PCR儀的性能指標(biāo)、操作規(guī)程及常見故障PCR擴(kuò)增儀的應(yīng)用內(nèi)容提要PCR核酸擴(kuò)增儀的工作原理

PCR技術(shù)的原理及發(fā)展PCR基因擴(kuò)增儀的工作原理PCR擴(kuò)增儀的分類與結(jié)構(gòu)

定性PCR擴(kuò)增儀實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀PCR儀的性能指標(biāo)、操作規(guī)程及常見故障PCR擴(kuò)增儀的應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)

（PolymeraseChainReaction）利用DNA變性、復(fù)性和復(fù)制的原理，在一對寡聚核苷酸引物的引導(dǎo)下，依靠DNA聚合酶的作用，通過變性-退火-延伸多次循環(huán)，將一段特異DNA片段高度擴(kuò)增的技術(shù)。一、PCR技術(shù)的原理（一）DNA的結(jié)構(gòu)與復(fù)制（二）PCR技術(shù)PCR(Polymerasechainreaction)：用一對寡聚核苷酸為引物，通過變性－退火－DNA合成這一周期的多次循環(huán)，使目的DNA片段得到擴(kuò)增。這種擴(kuò)增產(chǎn)物是以指數(shù)形式積累的，經(jīng)25－30個循環(huán)后，擴(kuò)增倍數(shù)可達(dá)106。

Dr.KarryMullis1985年發(fā)明，獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎。

PCR只是一個簡單的不起眼玩藝

——凱利·穆利斯（KaryMullis)

PCR只是一個概念，所發(fā)生的奇跡是：PCR概念變成了可操作的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，變成了一項(xiàng)成熟的技術(shù)，后者又上升成為新的概念?！?/p>

它最大的特點(diǎn)就是能不斷推出新形式。

——

摘自[MakingPCR:AStoryofBiotechnologybyPaulRabinow]

雙鏈DNA通過高溫變性解離成互補(bǔ)單鏈DNA

（變性）↓與一對寡核苷酸引物（5’，3’）降低溫度退火

DNA加熱變性+引物慢慢冷卻使其結(jié)合，形象地稱為退火↓適溫延伸5’/3’引物形成新鏈變成4條鏈DNA（延伸）↓第二輪：變性—退火—延伸呈指數(shù)增長理論值：一輪一倍10輪103=1000倍,20輪106,30輪109

理論模板擴(kuò)增30輪1ng-----------1g

實(shí)際模板擴(kuò)增30輪1ng-----------10

g5

Primer15

Primer2Cycle2Cycle15

5

5

5

5

5

TemplateDNA5

5

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目錄Cycle35

5

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5

25～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴(kuò)大100萬倍以上。目錄（二）PCR的反應(yīng)體系標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系4種dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA

0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+

1.5mmol/LTaqDNA聚合酶：

水生棲熱菌(thermusaquaticus,Taq)活性：有5’

3’DNA聚合酶活性；無3’

5’外切酶活性錯配率:35輪0.25%,與原始模板有關(guān)；最適溫度：72℃，選擇72℃延伸半衰期：92.5℃130min；95℃40min97.5℃5—6min

變性溫度：≤95℃，在整個擴(kuò)增循環(huán)中保持足夠活性1.DNA聚合酶pfuDNA聚合酶耐熱5’

3’DNA聚合酶活性3’→5’外切酶活性精確度：pfu>Taq

但pfu擴(kuò)增效率通常比Taq酶略差文獻(xiàn)報(bào)道：Taq+pfu會起到較好效果

2.引物

人工合成短寡核苷酸20bp-25bp→Tm=55℃-60℃，

Tm值要相近，每條10-50pmol/100l

◆設(shè)計(jì)原則：（1）靠近5'上游Primer與雙鏈DNA正鏈相同

3'下游Primer與雙鏈DNA正鏈互補(bǔ)，與負(fù)鏈相同正鏈5'—————3'——上游Primer

——下游Primer負(fù)鏈3'—————5'

例如：

IL-3正鏈

5'GCTCCATGACCCAG-----------GCGATCTTTTGAGTCCAA3'

負(fù)鏈3'CGCTAGAAAACTCAGGTT5'

上游~：與其相同下游~：先寫出相應(yīng)負(fù)鏈3'→5'然后倒過來5'→3'

所以負(fù)鏈Primer：5'-TTggACTCAAAAgATCgC-3'（2）Primer本身不要出現(xiàn)內(nèi)部互補(bǔ)序列形成loop環(huán)，內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)如：

GGGTCGATTCCTACCCATGC（3）注意減少Primer間互補(bǔ)序列導(dǎo)致2個Primer形成dimer

一般不要超過3個互補(bǔ)bp

如：CCCATGCATGGAGTC::::::::GGGTCTATCAGTAAGC

修飾如：32P、生物素、熒光素，不影響其效果

突變：

AGCTCCATGACCCAG

5'CGCTCCATGACCCAG3'

注意：絕不可以在3'端進(jìn)行上述改造∵DNA聚合酶是5'→3'聚合，若3'端改造→不能互補(bǔ)→不能延伸

（4）Primer5’未端可修飾、突變:

（5）primer5’端增加堿基

①內(nèi)切酶識別點(diǎn)：

（G）GAATTC

GCTCCATGACCCAG

↑保護(hù)bp

對PCR產(chǎn)物cloning有很大好處便于內(nèi)切酶消化，不同內(nèi)切酶需保護(hù)bP數(shù)量不同

EcoRI1BglII2-3XbaI2-3HindⅢ>3BamHI2-3PstI>4XhoI>4NotI>10

如果所用保護(hù)bp數(shù)量不合適→影響內(nèi)切酶消化→影響下步克隆∵未切開，連接不上

②ATG起始密碼③TAA、TAG、TGA終止密碼如：可溶性受體的表達(dá)，無膜內(nèi)區(qū)、穿膜區(qū)，只有膜外區(qū)。

3.模板：

可選：DNAmRNA→逆轉(zhuǎn)錄→cDNADNA包括：質(zhì)粒噬菌體染色體DNA

較小較大①目的gene是單拷貝變性較易變性較難②非常大，變性難模板用量

Plasmid:lngChromosome:300-500ng

注意：防止交叉污染4.dNTP：四種脫氧核苷酸，基本原料終濃度：50

M注意：不穩(wěn)定，保存時(shí)間長會失效

5.Mg2+TaqDNA聚合酶作用時(shí)需要Mg2+

不同的酶需不同Mg2+Taq：較少，Mg2+

對反應(yīng)影響很大，0.5-1.5mM終濃度

pfu：Mg2+2-3mM，dNTP、primer用量約增加一倍外界影響：

EDTA鰲合Mg2+∴選較低濃度TE(10mMTris,1mMEDTA)；

DNA模板、引物和dNTP的磷酸基團(tuán)均可與Mg2+

結(jié)合，降低Mg2+

有效濃度?！嗳绻麛U(kuò)增產(chǎn)物或效率不理想，要注意調(diào)整合適的

Mg2+濃度（1）變性溫度：94-95℃Templete：GC比例高、長度很長，則變性T↑

（2）退火：溫度越高，擴(kuò)增特異性越好取決于Tm值：Tm↑退火T↑；

Tm↓退火T↓若Tm較高，可使退火和延伸在同一溫度（3）延伸：

500nt---1min500nt－－3min一般：40－60sec

6.溫度和時(shí)間：PCR瓊脂糖凝膠電泳最終產(chǎn)物紫外光觀察3-4小時(shí)（四）PCR技術(shù)應(yīng)用基本流程1.PCR技術(shù)的特點(diǎn)靈敏度高皮克(pg=10-12)量級擴(kuò)增到微克(ug=10-6)水平能從100萬個細(xì)胞中檢出一個靶細(xì)胞病毒檢測的靈敏度可達(dá)3個RFU細(xì)菌檢測的最小檢出率為3個細(xì)菌簡便、快速一次性加好反應(yīng)液，2～4小時(shí)完成擴(kuò)增擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析對標(biāo)本的純度要求低血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等組織的粗提DNA（1）目的基因的克?。?）基因的體外突變（3）DNA和RNA的微量分析（4）DNA序列測定（5）基因突變分析

2.PCR技術(shù)的應(yīng)用二、PCR擴(kuò)增儀的分類與結(jié)構(gòu)PCR擴(kuò)增儀的種類

普通PCR擴(kuò)增儀

實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀

梯度PCR儀

原位PCR儀

根據(jù)變溫模式分類

水浴式PCR儀：由三個不同溫度的水浴槽和機(jī)械臂組成。變溫金屬塊式PCR儀：中心是由鋁塊或不銹鋼制成的熱槽，上有不同數(shù)目甚至不同規(guī)格的凹孔，用來放置樣品管。變溫氣流式PCR儀：由機(jī)殼、熱源、冷空氣泵、控制器及輔助元件等組成。（一）普通定性PCR擴(kuò)增儀

由普通PCR儀衍生出的帶梯度PCR功能的基因擴(kuò)增儀。每個孔的溫度可以在指定范圍內(nèi)按照梯度設(shè)置，

根據(jù)結(jié)果，一步就可以摸索出最適反應(yīng)條件。使用梯度PCR儀，多次實(shí)驗(yàn)可在一臺儀器上完成，既節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間，提高實(shí)驗(yàn)效率，又節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本。

（二）梯度PCR擴(kuò)增儀由普通PCR儀衍生出的帶原位擴(kuò)增功能的基因擴(kuò)增儀。其樣品基座上有若干平行的鋁槽，每條鋁槽內(nèi)可垂直放置一張載玻片，每張載玻片面均與鋁槽緊密接觸，溫度傳導(dǎo)極佳，控溫很精確。配有支持原位PCR模塊的PCR儀可以一機(jī)兩用，比較經(jīng)濟(jì)。（三）原位PCR擴(kuò)增儀實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀

金屬板式實(shí)時(shí)定量PCR儀

離心式實(shí)時(shí)定量PCR儀

各孔獨(dú)立控溫的定量PCR儀（四）熒光定量PCR儀熒光實(shí)時(shí)定量PCR（real-timequantitativePCR,RQ-PCR）技術(shù)在PCR反應(yīng)體系中加入特異性的熒光染料或探針，熒光信號的變化真實(shí)地反映了體系中模板的增加，通過檢測熒光信號，從而實(shí)時(shí)監(jiān)測整個PCR反應(yīng)過程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析。PCR儀溫度控制水浴鍋控溫壓縮機(jī)控溫

半導(dǎo)體控溫

離心式空氣加熱控溫

三、PCR儀的控溫指標(biāo)和控溫方式從PCR反應(yīng)基本原理可以看出，PCR基因擴(kuò)增儀工作關(guān)鍵是溫度控制。

（一）PCR儀的控溫指標(biāo)1.溫度的準(zhǔn)確性：指樣品孔溫度與設(shè)定溫度的一致性。對PCR擴(kuò)增儀而言溫度控制就意味著質(zhì)量。2.溫度的均一性：指樣品孔間的溫度差異，關(guān)系到不同樣品孔之間反應(yīng)結(jié)果的一致性?！拔恢玫倪吘壭?yīng)”會影響結(jié)果的可重復(fù)性。

3.升降溫的速度：升降溫速度快，可以提高工作效率，提高PCR反應(yīng)特異性。樣品管與基座接觸的緊密性、基座的導(dǎo)熱性、鄰近樣品管的相互影響都會影響樣品的實(shí)際升降溫速度。4.不同模式下的相同溫度特性：帶梯度功能的PCR儀，應(yīng)考慮儀器在梯度模式和標(biāo)準(zhǔn)模式下是否具有同樣的溫度特性。現(xiàn)有專利技術(shù)，能以同樣的溫度變化速率到達(dá)所有設(shè)定的梯度溫度。以不同溫度的水浴鍋串聯(lián)成一個控溫體系。樣品與水直接無縫接觸，控溫準(zhǔn)確，溫度均一性好，無邊緣效應(yīng)。體積大，自動化程度不高，需人為干預(yù)，更換水浴鍋時(shí)控溫不穩(wěn)定。（二）PCR儀的控溫方式由壓縮機(jī)自動控溫，金屬導(dǎo)熱，控溫較水浴鍋方便，一臺機(jī)器便可完成整個PCR流程。壓縮機(jī)故障率高，邊緣效應(yīng)及溫度overshooting現(xiàn)象嚴(yán)重。升溫過程中，由于一些加熱元件，比如半導(dǎo)體、金屬塊本身會積蓄能量，雖然溫度探頭探測溫度到達(dá)了設(shè)定溫度，但半導(dǎo)體、金屬塊上積蓄的能量仍然會傳給PCR體系，造成實(shí)際的溫度高于設(shè)定的溫度，即overshooting。1.由壓縮機(jī)自動控溫由半導(dǎo)體自動控溫，金屬導(dǎo)熱，控溫方便，體積小，相對穩(wěn)定性好。仍有邊緣效應(yīng)，溫度均一性尚有欠缺，各孔擴(kuò)增效率可能不一致，并且仍存在溫度overshooting現(xiàn)象。2.半導(dǎo)體自動控溫由金屬線圈加熱，采用空氣作為導(dǎo)熱媒介，溫度均一性好，各孔擴(kuò)增效率高度一致滿足熒光定量PCR的高要求，直接發(fā)展為離心式的定量PCR儀。金屬板式實(shí)時(shí)定量PCR儀可作為普通PCR儀使用可帶梯度功能可容納的樣本量大，無需特殊耗材溫度均一性欠佳，有邊緣效應(yīng)，標(biāo)準(zhǔn)曲線的反應(yīng)條件難以做到與樣品完全一致

ABI7500熒光定量PCR儀

MJ公司Chromo4熒光定量PCR儀

Bio-rad公司iCycler熒光定量PCR儀離心式實(shí)時(shí)定量PCR儀溫度均一性較好使用的是同一個激發(fā)光源和檢測器，隨時(shí)檢測旋轉(zhuǎn)到跟前的樣品，有效減少系統(tǒng)誤差可容納樣品量少，有的需用特殊毛細(xì)管作樣品管，增加了使用成本，也不帶梯度功能