藥物分析-藥物常見定量分析方法（藥物分析課件）

藥品含量測定之光譜法紫外-可見分光光度法1.概念紫外可見光區(qū)為200到760納米，是通過測定被測物質在特定波長處或一定波長范圍內的吸光度或發(fā)光強度，對該物質進行定性和定量分析的方法。2.特點靈敏度高，準確好，選擇性較好，操作簡單快捷。可用于藥物的鑒別檢查和含量測定，應用非常廣泛。具有芳香環(huán)或者是共軛雙鍵結構的化合物均對光具有吸收度。適用范圍在可見光區(qū)，很多物質本身沒有吸收，但可在一定的條件下加入顯色劑，或者是經過處理，使其顯色后再測定，因此，紫外可見分光光度方法適合于這類藥物的鑒別，純度檢查和含量測定。紫外-可見分光光度法3.基本原理（1）單色光輻射穿過被測物質溶液時，在一定的濃度范圍內被該物質吸收的量與該物質的濃度和液層的厚度（光路長度）成正比，朗伯-比爾定律如下：紫外-可見分光光度法式中A為吸光度；E為百分吸收系數，其物理意義為當溶液濃度為1%（g/ml），液層厚度為1cm時的吸光度數值；C為100ml溶液中所含物質的重量，L為液層厚度cm。紫外-可見分光光度法對照品比較法AC比色法BD標準曲線法

百分吸收系數法4.含量測定紫外-可見分光光度法4.含量測定分別配制供試品溶液和對照品溶液，在規(guī)定的波長處測定供試品溶液和對照品溶液的吸光度Ax和AR后，按下式計算供試品中被測溶液的濃度Cx（1）對照品比較法百分含量%計算公式為：紫外-可見分光光度法標示量

%

等于百分含量乘以平均片重再除以標示量。原料藥的含量百分比等于被測藥的濃度乘以原始體積乘以稀釋倍數D，除以取樣量，W是藥物的取樣量。4.含量測定紫外-可見分光光度法

式中：Cx：供試品溶液的濃度Ax：供試品溶液的吸光度CR：對照品溶液的濃度AR：對照品溶液的吸光度V：原始體積

W：供試品取樣量紫外-可見分光光度法4.含量測定例1：對照品比較法鹽酸氯丙嗪片劑的含量測定：取本品20片，精密稱定為8.100g，研細精密稱取0.4800g片粉，置于500ml量瓶中，加酸及水溶解并稀釋至刻度，取上清液5.00ml，置100ml量瓶中，加水至刻度，在254nm測得吸收度為0.540，另取鹽酸氯丙嗪對照品，配成6.0μg/ml的對照品溶液，同法在254nm處測的吸收度為0.564，標示量為50mg/片，計算標示量百分數。紫外-可見分光光度法4.含量測定已知：AX=0.540AR=0.564CR=6.0μg/mlD=100/5W取=0.4800g平均片重=8.100/20紫外-可見分光光度法4.含量測定按各品種項下的方法配制供試品溶液，在規(guī)定的波長處測定其吸光度，再以該品種在規(guī)定條件下的吸收系數計算含量。用本法測定時，吸收系數通常應大于100，并注意儀器的校正和檢定。（2）百分吸收系數法根據朗伯-比爾定律：得出：△C濃度是百分濃度，所以乘以一百分之一制劑是片劑的計算公式如下：△V是原始體積，D是稀釋倍數紫外-可見分光光度法制劑是注射劑的計算公式如下：紫外-可見分光光度法4.含量測定例2：對乙酰氨基酚原料藥含量測定：精密稱取對乙酰氨基酚0.0411g，置250ml量瓶中，加0.4%氫氧化鈉溶液50ml，加水至刻度，搖勻，精密量取5ml，置100ml量瓶中，加0.4%氫氧化鈉溶液10ml，加水至刻度，搖勻。依照分光光度法，在257nm波長處測得吸收度為0.582。按C8H9NO2的百分吸收系數為719計算對乙酰氨基酚的百分含量。紫外-可見分光光度法4.含量測定已知：A=0.582E=719V原始=250ml

D=100/5W取=0.0411g紫外-可見分光光度法4.含量測定例3：維生素B1注射液含量的測定：精密量取本品（規(guī)格2ml：50mg）2ml，置200ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，精密量取5ml，置100ml量瓶中，加鹽酸溶液（9→1000）稀釋至刻度，照紫外-可見分光光度法（附錄ⅣA），在246nm的波長處測得吸光度為0.521，按維生素B1的吸收系數（）為421，計算本品相當于標示量的百分含量。紫外-可見分光光度法4.含量測定已知：A=0.521

E=421

V原始=2ml

D=200/2×100/5W取=0.0411g

標示量為：50mg每支容量=2ml紫外-可見分光光度法指供試品本身在紫外可見光區(qū)沒有吸收或在紫外光區(qū)雖然有吸收，為了避免干擾或者是提高靈敏度，可加入適當的顯色劑，顯色后測定。紫外-可見分光光度法（3）比色法4.含量測定以吸光度與相應的濃度繪制成標準曲線后再根據供試品的吸光度，在標準曲線上查得其相應的濃度，并求出其含量。紫外-可見分光光度法（4）標準曲線方法藥品含量測定之容量分析法藥品劑量太小，達不到有效的血藥濃度，起不到治療作用，劑量過大，則容易引起中毒反應，有些藥品因所治疾病不同，劑量也會有很大差異。概述解熱鎮(zhèn)痛每次0.3～0.6g治療風濕性關節(jié)炎每次0.6～1.0g預防心肌梗死每次0.05～0.1g

阿司匹林劑量不同用途不同基于生物學原理——“效價測定”藥物定量分析1.概念藥物定量分析是指運用物理、化學或生物化學的方法和技術，測定藥品中有效成分或指標性成分的含量，它是評價藥品質量、判斷藥物優(yōu)劣的重要手段。2.分類基于物理或化學原理——“含量測定”藥物定量分析方法化學分析法儀器分析法藥物定量分析重量分析法容量分析法電化學分析法色譜法分光光度法1.名稱

原理：將一種已知準確濃度的滴定液滴加至待測物質的溶液中，直到化學反應完全作用為止，然后根據所用滴定液的濃度和體積計算出待測物質含量的分析方法，又稱“滴定分析法”。容量分析方法廣泛應用于化學原料藥的含量測定。容量分析法2.特點優(yōu)點方法簡便易行：儀器設備簡單、易于操作、成本低、速度較快。方法耐用性高：影響條件與環(huán)境因素較少。測定結果準確：相對誤差在0.2%以下。缺點方法專屬性差：對結構相近的有關物質或其他干擾雜質缺乏選擇性，故一般適用于主成分含量較高的試樣的分析。△原料藥純度達到98.5%以上時首選容量分析法。容量分析法3.分類酸堿滴定法氧化還原滴定法配位滴定法非水溶液滴定法亞硝酸鈉滴定分析法容量分析法1.概念（2）校正因子每1ml規(guī)定濃度的滴定液所相當的被測藥物的質量，用T（mg/ml）來表示：被測物WA=T×VB（1）滴定度校正因子等于滴定液的實際濃度與滴定液的規(guī)定濃度之比，而實際的滴定度等于藥典規(guī)定的滴定度乘以校正因子。容量分析法容量分析法的有關計算2.原料含量△原料：百分含量，即測得量與取樣量之比V：消耗滴定液的體積（ml）T：滴定度（mg/ml）F：滴定液的濃度校正因數W：稱樣量（mg）F=滴定液實際標定的濃度/規(guī)定的濃度（1）直接滴定法

2.原料含料精密稱取本品0.4018g，加中性乙醇20ml溶解后，加3滴酚酞指示劑，用NaOH滴定液（0.1002mol/L）滴定至粉紅色，消耗體積為22.20ml，求阿司匹林的含量？（ch.p每1ml0.1mol/L的NaOH滴定液相當于18.02mg的阿司匹林）例1：阿司匹林的含量測定解題思路：已知取樣量W=0.4018gV=22.20mlT=18.02mg容量分析法的有關計算

=99.80%△公式的上下單位一定要統一容量分析法的有關計算制劑含量：標示量的百分含量。就是每片/每支實際測得量與標示量之比。標示量也是藥品的規(guī)格。容量分析法的有關計算3.制劑含量公式中的

W表示平均片中，前半部分是百分含量，百分含量乘以平均片中得的是每片中藥物的實際含量，再除以標示量，得到標示量%。（2）制劑直接滴定法測定含量計算公式：容量分析法的有關計算3.制劑含量例2：甲苯磺丁脲片劑的含量測定（標示量0.5g/每片）取甲苯磺丁脲10片，精密稱定為5.9480g，研細，精密稱取片粉0.5996g，加中性乙醇25ml，微熱，使其溶解，放冷，加酚酞指示劑3滴，用氫氧化鈉滴定液（0.1008mol/L）滴定至粉紅色，消耗量18.47ml。每1ml氫氧化鈉滴定液（0.1mol/L）相當于27.04mg的甲苯磺丁脲。試計算本品的標示量百分含量，并判斷是否符合規(guī)定。容量分析法的有關計算3.制劑含量直接滴定法→片劑→公式已知：V→18.47mlT→27.04×10-3g/ml平均片重→5.9480/10=0.5948g容量分析法的有關計算3.制劑含量例3：鹽酸普魯卡因注射劑（規(guī)格1ml∶50mg）含量測定精密量取鹽酸普魯卡因注射液2ml，加水40ml，鹽酸溶液（1→2）15ml，溴化鉀2克，照永停滴定法，用亞硝酸鈉滴定液（0.1032mol/L）滴定，消耗亞硝酸鈉滴定液（0.1032mol/L）體積3.50ml。每1ml亞硝酸鈉滴定液（0.1mol/L）相當于27.18mg的C13H2lN30·HCI。求本品的百分含量。

容量分析法的有關計算3.制劑含量消耗滴定液的體積V=3.5ml，T=27.18mg，V取=2ml。

規(guī)格1ml∶50mg是每支容量為1ml，標示量為50mg。容量分析法的有關計算容量分析法的有關計算藥品含量測定之色譜法色譜分析方法概念將混合物當中各組分分離后在線或者是離線分析的一種分析方法，具有靈敏度高，選擇性高，分析速度快，應用范圍廣等特點，是復方制劑含量測定的首選方法。高效液相色譜方法氣相色譜方法離子色譜方法凝膠色譜方法1.基本原理采用高壓輸液泵將規(guī)定的流動相泵入裝有填充劑的色譜柱，對供試品進行分離測定的色譜方法。注入的供試品，由流動相帶入色譜柱內，各組分在柱內被分離，并進入檢測器檢測，由色譜工作站記錄和處理色譜信號。一、高效液相色譜法高效液相色譜法是分析混合物最有利的手段。廣泛應用于藥物制劑的含量測定，尤其是復方制劑、中成藥及抗生素類藥的含量測定的首選方法。一、高效液相色譜法高效液相色譜法根據固定相與流動相極性的相對強弱，分為正相色譜和反相色譜。流動相極性大于固定相極性稱為反相色譜，反之，為正相色譜。一、高效液相色譜法2.高效液相色譜儀常用的色譜柱填充劑有常用十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18）、離子交換填充劑、凝膠或高分子多微球填充劑，十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18）最為常用。檢測器檢測器有紫外檢測器，有二極管陣列檢測器，熒光檢測器，示差折光檢測器，蒸發(fā)光散射檢測器，電化學檢測器和質譜檢測器等等，最常用的是紫外檢測器?！鞲邏狠斠罕?、進樣器、色譜柱、檢測器、數據處理系統組成。色譜柱一、高效液相色譜法流動相流動相使用前應采用0.45μm濾膜濾過并經脫氣處理，流動相中應盡可能不用緩沖鹽。用十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱時，流動相中有機溶劑一般不低5%。反相色譜系統常用流動相首選甲醇-水系統；采用紫外末端波長檢測時，首選乙腈-水系統。色譜柱保存時應保持填料在濕潤狀態(tài)，兩端密塞，如C18柱可在甲醇中保存。2.高效液相色譜儀一、高效液相色譜法以上三個條件是不能隨意改變的。如色譜柱內徑與長度、填充劑粒徑、流動相流速、混合流動相各組分比例、柱溫、進樣量、檢測器靈敏度等均可適當改變。一、高效液相色譜法理論塔板數分離度靈敏度拖尾因子重復性高效液相色譜儀系統適用性試驗一、高效液相色譜法用于評價色譜柱的分離效能。由于不同物質在同一色譜柱上的色譜行為不同，采用理論板數作為衡量色譜柱效能的指標時，應指明測定物質，一般為待測物質或內標物質的理論板數。（1）色譜柱的理論板數（n）2.高效液相色譜儀一、高效液相色譜法色譜柱的理論板數越多，柱效越高。一、高效液相色譜法在規(guī)定的色譜條件下，注入供試品溶液或各品種項下規(guī)定的內標物質溶液，記錄色譜圖，量出供試品主成分色譜峰或內標物質色譜峰的保留時間

tR

和峰寬（W）或半高峰寬（Wh/2），計算色譜柱的理論板數：用于評價待測物質與被分離物質之間的分離程度，是衡量色譜系統分離效能的關鍵指標。除另有規(guī)定外，待測物質色譜峰與相鄰色譜峰之間的分離度應大于1.5。（2）分離度（R)2.高效液相色譜儀一、高效液相色譜法（3）靈敏度用于評價色譜系統檢測微量物質的能力，通常以信噪比（S/N）來表示。定量測定時，信噪比應不小于10；定性測定時，信噪比應不小于3。一、高效液相色譜法2.高效液相色譜儀用于評價連續(xù)進樣中，色譜系統響應值的重復性能。（4）重復性（R)采用外標法時，取對照溶液，連續(xù)進樣5次，峰面積RSD應≤2.0%；采用內標法時，配制相當于80%、100%、120%的對照液，加入規(guī)定的內標，分別進樣3次，計算平均校正因子，RSD亦應≤2.0%。一、高效液相色譜法用于評價色譜峰的對稱性，除另有規(guī)定外，拖尾因子T值應在0.95～1.05之間。（5）拖尾因子(T)2.高效液相色譜儀一、高效液相色譜法高效液相色譜法進行藥物含量測定有兩種方法：外標法和內標法一、高效液相色譜法供試品→供試品溶液對照品→對照品溶液進樣，測量對照品溶液和供試品溶液中待測物質的峰面積（或峰高）。（1）外標法缺點：不易精確控制進樣量，宜選用定量環(huán)或自動進樣。3.測定法一、高效液相色譜法取對照品和內標物質，分別配成溶液，各精密量取適量，混合配成對照溶液。取一定量進樣，記錄色譜圖。測量對照品和內標物質的峰面積或峰高。（2）內標法AS為內標物質的峰面積或峰高；AR為對照品的峰面積或峰高；CS為內標物質的度；CR為對照品的濃度。3.測定法一、高效液相色譜法供試品+內標→供試品溶液，進樣，測定供試品和內標物質的峰面積或峰高，計算含量。（2）內標法3.測定法采用內標法，可避免因供試品前處理及進樣體積誤差對測定結果的影響。一、高效液相色譜法3.測定法例1：外標法測定鹽酸環(huán)丙沙星原料藥的百分含量供試品的測定：精密稱取本品51.24mg，放置到100ml容量瓶中加流動相稀釋至刻度，搖勻；精密取10μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，樣品峰面積為13004；對照品的測定：另精密稱取鹽酸環(huán)丙沙星對照品51.07mg，同法測定，記錄峰面積為14325。一、高效液相色譜法一、高效液相色譜法二、氣相色譜法1.概念采用氣體為流動相（載氣）流經裝有填充劑的色譜柱進行分離測定的色譜方法。物質或其衍生物氣化后，被載氣帶入色譜柱進行分離，各組分先后進入檢測器。用數據處理系統記錄色譜信號。氣相色譜法主要用于用于溶劑殘留量的檢查、乙醇測定、揮發(fā)性雜質檢查或者本身具揮發(fā)性，加熱氣化的供試品的測定。二、氣相色譜法應用2.特點許多樣品難以氣化，操作較繁雜，沒有高效液相色譜法應用廣泛。分離度高，靈敏度好。缺點優(yōu)點氣相色譜法二、氣相色譜法藥物分析中主要應用于原料當中，殘留溶劑和揮發(fā)性雜質的檢查，以及因含雜質干擾有具有一定揮發(fā)性的藥品的含量測定。色譜柱3.儀器要求二、氣相色譜法載氣源（流動相）常用載氣有氮氣、氦氣和氫氣，最為常用載氣為氮氣。為填充柱或毛細管柱。色譜聯用技術及其應用質譜法（MS）是在離子源中將分子解離成氣態(tài)離子，測定生成離子的質量和強度（質譜），進行定性和定量分析的常用譜學分析方法。概述（一）液相色譜-質譜聯用技術1.概念高效液相色譜-質譜聯用技術（LC-MS）將高分離能力、使用范圍極廣的液相色譜分離技術與高靈敏、高專屬的質譜技術結合起來，成為一種強有力、多用途的定性、定量分析工具。（一）液相色譜-質譜聯用技術2.應用藥物（包括生物大分子）結構信息的獲取、分子質量的確定藥物質量控制（藥物雜質、異構體、抗生素組分的分析）藥物的體內過程分析、藥物代謝產物研究ABCF（一）液相色譜-質譜聯用技術2.應用臨床血藥濃度檢測代謝組學蛋白組學高通量藥物篩選研究DE（一）液相色譜-質譜聯用技術3.組成高效液相色譜-質譜聯用儀器由高效液相色譜系統（進樣系統）、色譜-質譜接口（離子源和真空接口）、質量分析器等部分組成。這些離子經真空接口進入質量分析器，按質荷比（m/z）分離經進樣系統引入的待測化合物，在離子源中生成氣態(tài)正離子（或負離子）獲得待測化合物的質譜圖（一）液相色譜-質譜聯用技術離子檢測器檢測檢測信號經轉換計算機系統處理若待測樣品經色譜分離后，被部分或全部的依次引入離子源時，將獲得該待測樣品的色譜圖。（一）液相色譜-質譜聯用技術外標法和內標法是質譜常用的定量方法，內標法具有更高的準確度。質譜法可實現高專屬性、高靈敏度的定量分析。定量分析采用選擇離子檢測或選擇反應檢測、多反應檢測等方式，通過測定某一特定離子或多個離子的豐度，并與已知標準物質的響應比較。LC-MS將液相色譜與質譜聯用，特別適合組分復雜樣品和微痕量樣品的分離分析。在中藥成分分析、抗生素分析、體內藥物分析等方面得到廣泛應用。（一）液相色譜-質譜聯用技術（二）氣相色譜-質譜聯用技術1.概念現行版《中國藥典》通則增訂了中藥材農藥殘留量測定法，其中包括了用氣相色譜-質譜聯用技術測定74種農殘，為中藥材農殘測定確定了分析方法，具有更好的特異性和靈敏性。2.組成氣相色譜-質譜聯法（GC-MS）將高效的氣相色譜分離技術與能夠提供豐富結構信息和專屬性定量結果的質譜技術相結合，廣泛應用于易揮發(fā)的或經衍生化處理后易揮發(fā)的有機物分析。（二）氣相色譜-質譜聯用技術GC-MS法與LC-MS法互補，已成為藥物研究、生產、臨床檢測的重要技術手段。（二）氣相色譜-質譜聯用技術計算機系統用于氣相色譜、接口和質譜儀的控制，同時進行數據采集和處理。質譜作為氣相色譜的檢測器，將分離后的各組分分別離子化、離子檢測。接口把氣相色譜流出的各組分導入處于真空狀態(tài)的質譜儀，起著氣相色譜和質譜之間適配器的作用。氣相色譜儀在大氣壓下分離待測樣品中的各組分。（二）氣相色譜-質譜聯用技術注意選用高純氦氣作為載氣；GC-MS所用毛細管色譜柱應為MS專用柱。供試樣品應采用非水溶劑溶解，濃度一般控制在ppb級。比較復雜的混合物樣品一般不宜直接進樣。3.注意事項（二）氣相色譜-質譜聯用技術樣品前處理樣品前處理是指在樣品分析前要采用一定的方法，使待測藥物純化或待測元素轉化為適宜的狀態(tài)后再進行分析測定。樣品前處理1.目的樣品前處理消除干擾，保護儀器。提高方法的準確度、精密度、選擇性和靈敏度。分析檢測的關鍵環(huán)節(jié)。前處理對象前處理方法樣品前處理含金屬（Ca、Fe、Zn、Hg）鹵素（F、Cl、Br、I）、N元素、P、S不經有機破壞經有機破壞樣品前處理1.不經有機破壞的分析方法對藥物分子的有機結構部分不進行完全破壞，通過選用適當溶劑溶解或經簡單回流處理，使待測元素電離、離解，轉化為無機離子進行測定，適用于含金屬有機藥物或結合不牢固的含鹵素藥物的分析。方法包括直接溶解法、提取分離法中的加熱回流、超聲處理、索氏提取、水蒸氣蒸餾法、冷浸或滲漏法、萃取濃集法化學分解法……樣品前處理2.經有機破壞的分析方法某些藥品中含有機氮、硫、磷及有機金屬離子與碳原子結合牢固，用上述方法難以成為無機的化合物，此時必須采用有機破壞的方法，使之轉變?yōu)闊o機化合物，方可進行測定。樣品前處理方法包括濕法破壞法和干法破壞法。破壞法2.經有機破壞的分析方法

（1）濕法破壞法1、硝酸—高氯酸方法2、硫酸—硫酸鹽方法3、硝酸—硫酸法方法4、其他濕法主要采用強酸進行有機破壞，將有機結合的待測元素轉變?yōu)榭蓽y定無機化合物。本法可用于生物制品中氮、磷或金屬元素的測定。以硫酸-硫酸鹽法為基礎的含氮有機藥物定量分析方法。適用于含氮有機藥物前處理。例：凱氏定氮法用濃硫酸進行消解消解液加氫氧化鈉蒸餾，用2%硼酸溶液吸收生成硼胺再用稀硫酸滴定2.經有機破壞的分析方法

樣品前處理高溫熾灼法氧瓶燃燒法2.經有機破壞的分析方法

（2）干法破壞法適用于含鹵素、硫、磷等有機物的前處理，亦可用于含硒、砷鹽藥物的測定。樣品前處理主要用于含鹵素藥物的鑒別。本法將有機藥物經高溫灼燒灰化，使有機結構分解而待測元素轉化為無機元素或可溶性的無機鹽。樣品前處理（1）高溫熾灼法將有機藥物放入充滿氧氣的密閉燒瓶中進行燃燒，將燃燒所產生的待測物質吸收在適當吸收液中，采用適當分析方法進行鑒別、檢查或含量測定。適用于含鹵素及硫、磷、硒等藥物的鑒別、檢查和含量測定。（2）氧瓶燃燒法樣品前處理2.經有機破壞的分析方法

分析方法的驗證藥品質量標準分析方法驗證的目的是證明采用的方法適合于相應檢測要求。分析方法的驗證對原分析方法進行修訂

建立藥品質量標準AC制劑的組分變更BD

藥品生產工藝變更需要進行方法驗證的情況方法驗證的理由、過程和結果均應記載在藥品質量標準起草說明或修訂說明中。分析方法的驗證質量標準中需要驗證的項目鑒別試驗、限量或定量檢查、原料藥或制劑中有效成分含量測定、制劑中其他成分藥品溶出度、釋放度等檢查中溶出量等的測定方法。準確度、精密度、專屬性、檢測限、定量限、線性、范圍和耐用性。在分析方法驗證中，須采用標準物質進行試驗。分析方法的驗證指標分析方法的驗證一、準確度準確度系指采用該方法測定的結果與真實值或參考值接近的程度，一般用回收率（%）表示。準確度應在規(guī)定的范圍內測定。

加樣回收率測定——向已知被測成分含量的供試品中精密加入一定量的被測成分對照品，用實測值與供試品中含有量之差，除以加入對照品量計算回收率。

數據要求：9個測定結果，3個不同濃度，每個濃度各3份(80，100，120％)分析方法的驗證在規(guī)定的條件