體內(nèi)藥物分析

第五章

體內(nèi)藥物分析2024/7/192第五章

體內(nèi)藥物分析常用體內(nèi)樣品的制備與貯藏

1體內(nèi)樣品分析的前處理2體內(nèi)樣品分析方法與方法驗(yàn)證32024/7/193第五章熟悉:

體內(nèi)樣品的采集與制備方法 體內(nèi)樣品分析方法驗(yàn)證的技術(shù)要求了解:體內(nèi)藥物分析的性質(zhì)與意義掌握:

體內(nèi)藥物分析的特點(diǎn)和應(yīng)用 體內(nèi)樣品分析的前處理 體內(nèi)樣品分析方法驗(yàn)證的內(nèi)容2024/7/194體內(nèi)藥物分析

學(xué)習(xí)要求體內(nèi)藥物分析的特點(diǎn)和應(yīng)用體內(nèi)樣品分析的前處理體內(nèi)樣品分析方法驗(yàn)證內(nèi)容體內(nèi)藥物分析的性質(zhì)與意義體內(nèi)樣品的采集與制備方法體內(nèi)樣品分析方法驗(yàn)證的技術(shù)要求掌握

了解熟悉2024/7/195概述體內(nèi)藥物分析方法建立與驗(yàn)證凈化與濃集原形,代謝物體液或組織色譜;免疫分析;生物

全面驗(yàn)證和部分驗(yàn)證

原形藥物或其代謝物

綴合物,蛋白結(jié)合物

體內(nèi)樣品存在形式樣品制備分析方法去蛋白;萃取;膜分離水解;化學(xué)衍生化血液是主要樣品尿液,唾液,頭發(fā)和臟器2024/7/196概述1.體內(nèi)樣品的特點(diǎn)(1)采樣量少:ml~μl級(jí);且不易重新獲得

(2)待測(cè)物濃度低:μg/ml~ng/ml級(jí),甚至pg/ml(3)干擾物質(zhì)多:尤其是血樣和組織中的蛋白質(zhì)2.體內(nèi)藥物分析的特點(diǎn)(1)樣品需經(jīng)純化濃集,或化學(xué)衍生化處理(2)對(duì)分析方法的靈敏度及專屬性要求較高

(3)分析工作量大,數(shù)據(jù)處理和結(jié)果闡明繁雜

體內(nèi)藥物分析的特點(diǎn)主要來(lái)自于體內(nèi)樣品的特點(diǎn)特點(diǎn)2024/7/197第一節(jié)

常用體內(nèi)樣品的制備與貯藏

體內(nèi)樣品的種類1體內(nèi)樣品的采集與制備2體內(nèi)樣品的貯藏與處理32024/7/198體液組織排泄物一、體內(nèi)樣品的種類體內(nèi)樣品血液;唾液腦脊液;胃液;膽汁;乳汁;精液;淚液尿液糞便;汗液胃;腸;肝;腎;肺,腦;肌肉;頭發(fā)2024/7/199常見體內(nèi)樣品1.血樣的采集

靜脈,1-5ml≤1/10

2.血漿的制備

抗凝劑,1000

g離心5-10min淡黃色上清液

3.血清的制備

30min-1h

1000

g離心

5-10min上層淡黃色液體

4.全血的制備抗凝劑,不離心1.尿樣的特點(diǎn)

原形,代謝物及綴合物藥物濃度較高收集量大(1~5L)

2.尿樣的采集

自然排尿規(guī)定時(shí)間段(6-8h)(時(shí)間尿)

3.尿樣的貯藏

加入適當(dāng)防腐劑TDM測(cè)定S代替P進(jìn)行臨床監(jiān)測(cè)

1.唾液的組成腮腺,舌下腺和頜下腺

2.唾液的采集漱口15min,安靜狀態(tài),自然流出的唾液

物理或化學(xué)方法刺激3.樣品的制備3000r/min離心10min,上清液1.樣品的制備制成水性基質(zhì)勻漿溶液

2.樣品的處理(1)沉淀蛋白法(2)酸/堿水解法(3)酶水解法蛋白水解酶中的枯草菌溶素血樣尿樣唾液組織二、體內(nèi)樣品的采集與制備50-60％20-40％2024/7/1910三、體內(nèi)樣品的貯存與處理(一)冷藏與冷凍短期保存:冰箱(4℃)冷藏長(zhǎng)期保存:冷柜(-20℃/-70~-80℃)冷凍,小體積分裝1.血漿/血清:

分離(≯2h),硬質(zhì)玻璃/聚乙烯管(EP),冷凍2.尿樣:

冷藏(24~36h)加防腐劑3.唾液:

冷凍保存時(shí),解凍后充分?jǐn)噭蚝笤儆?二)去活性采樣后立即終止酶的活性常用方法:液氮速凍,微波照射,勻漿/沉淀,加酶活性阻斷劑(氟化鈉)或抗氧劑(VC),煮沸2024/7/1911第二節(jié)

體內(nèi)樣品分析的前處理

體內(nèi)樣品預(yù)處理的目的1常用體內(nèi)樣品預(yù)處理方法2

前處理(分離,濃集,改性)為藥物的測(cè)定提供條件

前處理是體內(nèi)藥物分析過(guò)程中重要且繁復(fù)的工作2024/7/1912儀器污染,劣化(去蛋白)提高測(cè)定靈敏度/選擇性化學(xué)改性(衍生化)

血漿蛋白結(jié)合物;綴合物使待測(cè)藥物/代謝物釋放測(cè)定藥物/代謝物總濃度

1.使待測(cè)組分游離

2.滿足測(cè)定方法的要求

3.改善分析環(huán)境

一、體內(nèi)樣品前處理的目的樣品介質(zhì)組成復(fù)雜:分離待測(cè)組分濃度低:濃集

前處理2024/7/1913二、體內(nèi)樣品前處理的方法

去除蛋白質(zhì)法分離與濃集法綴合物水解法

(一)(二)(三)化學(xué)衍生化法

(四)2024/7/1914(一)去除蛋白質(zhì)法加入與水混溶的有機(jī)溶劑,蛋白析出→藥物釋放乙腈,甲醇,丙酮,四氫呋喃等血漿/血清與有機(jī)溶劑的體積比1∶(2-3)

飽和硫酸銨,硫酸鈉,硫酸鎂,氯化鈉等血清與飽和硫酸銨溶液的比1∶2

10%三氯醋酸或6%高氯酸溶液血清與強(qiáng)酸的比1∶0.6上清液呈強(qiáng)酸性(pH≤4)酸性分解的藥物不宜用熱變性蛋白質(zhì)沉淀通常90℃方法簡(jiǎn)單只能除去熱變性蛋白待測(cè)物熱穩(wěn)定性好

1.溶劑沉淀法2.中性鹽析法3.強(qiáng)酸沉淀法4.熱凝固法2024/7/1915(二)分離與濃集法液相萃取法固相萃取法超濾法1.2.3.2024/7/19161.液相萃取法溶劑的選擇原則溶劑的用量水相的pH(1)(2)(3)提取操作(4)2024/7/1917(1)溶劑的選取原則①對(duì)藥物分子未電離形式可溶,對(duì)電離形式不溶；②沸點(diǎn)低,易揮發(fā);③與水不相混溶;④無(wú)毒,不易燃燒;⑤具有化學(xué)穩(wěn)定和惰性;⑥不影響紫外檢測(cè)

溶劑紫外截止波長(zhǎng)(nm)沸點(diǎn)(℃)↓極性增加↓正己烷21069環(huán)己烷21081甲苯285111異丙醚*22068乙醚*22035醋酸戊酯285149三氯甲烷

24561甲基異丁基酮230116醋酸乙酯26077正丁醇215118*:含過(guò)氧化物；

:肝臟毒性,有致癌作用①輔助試劑的使用乙醚(1.2%水):氯化鈉②混合溶劑的使用

正己烷-異丙醇(95:5)2024/7/1918(2)溶劑的用量有機(jī)相與水相(樣品)體積比為1:1~5:1堿性藥物pH高于pKa1~2單位酸性藥物pH低于pKa1~2單位堿性下提取,可減少內(nèi)源性物質(zhì)(酸性)的干擾堿性下不穩(wěn)定,在中性用三氯甲烷和異丙醇提取(3)水相的pH提取1次若提取回收率較低(低于50%),提取2~3次脂溶性干擾物,可進(jìn)行小體積水溶液反提取

(4)提取操作

2024/7/19192.固相萃取法固相萃取法的原理

固相萃取法操作步驟

注意事項(xiàng)

(1)(2)(3)固相萃取法的特點(diǎn)

(4)自動(dòng)化固相萃取

(5)2024/7/1920(1)固相萃取法的原理 含藥物體內(nèi)樣品通過(guò)小柱時(shí),受到“吸附”,“分配”,“離子交換”或其它親和力作用,藥物及內(nèi)源性物質(zhì)同時(shí)被保留在固定相(填料)

洗脫方式有兩種:①?zèng)_洗溶劑洗去干擾物,再用對(duì)藥物親和力更強(qiáng)的溶劑洗脫藥物;②藥物直接被洗脫,干擾物保留2024/7/1921(2)固相萃取法操作步驟

第1步:甲醇潤(rùn)濕小柱,活化填料;凈化填料

第2步:水/緩沖液沖洗小柱,去除甲醇;甲醇含量過(guò)低(低于5%)致C18鏈彎曲折疊,回收率降低

第3步:加樣,使樣品通過(guò)小柱,并棄去濾過(guò)液

第4步:水/緩沖液沖洗小柱,去除內(nèi)源性及其它干擾物質(zhì)第5步:洗脫溶劑洗脫待測(cè)物,收集洗脫液,平衡2024/7/1922(3)注意事項(xiàng)①樣品(血漿)通過(guò)萃取柱的流速在1-2ml/min;②沖洗液和洗脫劑的強(qiáng)度與用量適當(dāng),否則導(dǎo)致藥物損失/選擇性下降,通常選用可與水混溶的洗脫劑;③萃取堿性藥物時(shí),洗脫劑中常加酸,有機(jī)胺,氨水,醋酸銨或離子對(duì)試劑2024/7/1923(4)固相萃取法的特點(diǎn)2024/7/1924(5)自動(dòng)化固相萃取法對(duì)于單個(gè)樣品處理,SPE操作省時(shí)對(duì)于大量樣品的處理半自動(dòng)SPE:萃取過(guò)程機(jī)械化全自動(dòng)化儀器:通過(guò)柱切換技術(shù)實(shí)現(xiàn)固相萃取與HPLC聯(lián)用2024/7/1925柱切換:固相萃取-LC/MS/MS(5)自動(dòng)化固相萃取法2024/7/19263.超濾法ultrafiltration是一種膜分離技術(shù)按照截留分子量,選擇半透膜,可分離30~1000kD的可溶性生物大分子無(wú)化學(xué)試劑,無(wú)相變化提取操作(4)簡(jiǎn)便,游離藥物分析的首選方法;尤其適合TDM2024/7/1927(三)綴合物水解法簡(jiǎn)便,快速

水解過(guò)程中發(fā)生藥物分解專一性較差葡萄糖醛酸苷酶或/和硫酸酯酶專屬性強(qiáng)時(shí)間較長(zhǎng)可引入粘蛋白溶劑萃取過(guò)程中綴合物(尤其硫酸酯)直接分解測(cè)定尿藥總量,水解綴合物趨向于直接測(cè)定綴合物1.酸水解法2.酶水解法3.溶劑解法2024/7/1928(四)化學(xué)衍生化法1.在GC中的應(yīng)用(1)硅烷化:三甲基硅烷(TMCS)(2)?；?三氟乙酸酐(TFAA)(3)烷基化:碘庚烷(C7H15I)(4)不對(duì)稱衍生化:(S)-N-三氟乙酰脯氨酰氯(ST-FPC)2.在HPLC中的應(yīng)用(1)衍生化的分類

柱前/柱后;在線/離線(2)衍生化方法

(1)紫外衍生化

(2)熒光衍生化

(3)非對(duì)映體衍生化GC:①提高藥物的揮發(fā)性;②增加藥物的穩(wěn)定性;③生成非對(duì)映異構(gòu)體

HPLC:①提高檢測(cè)靈敏度;②改善色譜分離容量分析法2024/7/1929第三節(jié)

體內(nèi)樣品分析方法與方法驗(yàn)證分析方法的建立一、分析方法的驗(yàn)證二、2024/7/1930一、分析方法的建立分析方法的選擇分析方法建立的一般程序(一)(二)2024/7/1931(一)分析方法的選擇

HPLC,GCHPLC-MSn,GC-MS

RIA,EIA,FIA;適用于大分子TDM應(yīng)用較多抗生素生物利用度,等效性,TDM應(yīng)用較少常用的檢測(cè)方法: 色譜分析法,免疫分析法 和生物學(xué)方法免疫分析法色譜分析法生物學(xué)方法2024/7/1932(二)分析方法建立的一般程序

待測(cè)物,內(nèi)標(biāo)(必要時(shí))的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜柱(填料),流動(dòng)相,溶劑,進(jìn)樣量試劑/溶劑試驗(yàn);生物介質(zhì)試驗(yàn)質(zhì)控樣品試驗(yàn)代謝產(chǎn)物對(duì)待測(cè)物,內(nèi)標(biāo)物的干擾配伍用藥的干擾分析方法的建立和驗(yàn)證過(guò)程系同步進(jìn)行為便于討論,以色譜分析法為例分別敘述1.色譜條件的篩選2.色譜條件的優(yōu)化3.實(shí)際樣品的測(cè)試2024/7/1933二、分析方法的驗(yàn)證特異性標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量范圍定量下限

(一)(二)(三)精密度與準(zhǔn)確度

(四)樣品穩(wěn)定性

(五)提取回收率

(六)方法樣品2024/7/1934二、分析方法的驗(yàn)證分析過(guò)程的質(zhì)量控制未知樣品濃度超限的處理藥用內(nèi)源性物質(zhì)的測(cè)定

(七)(八)(九)微生物/免疫學(xué)方法的驗(yàn)證(十)名詞解釋(十一)分析其他2024/7/1935(一)特異性

比較標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與6個(gè)不同個(gè)體的空白生物介質(zhì)和QC樣品軟電離質(zhì)譜(LC-MS)介質(zhì)效應(yīng)比較QC樣品和至少6個(gè)不同個(gè)體用藥后的實(shí)際樣品必要時(shí)LC-DAD/MS確證峰的單一/同一

比較待測(cè)藥物,同服藥物,待測(cè)藥物的QC樣品和添加有同服藥物的干擾樣品特異性(specificity),又稱專屬性或?qū)Ｒ恍? 通常與選擇性(selectivity)互用1.內(nèi)源性物質(zhì)2.未知代謝物

3.伍用藥物4.參比方法參比方法橫坐標(biāo)(x),擬定方法縱坐標(biāo)(y),最小二乘y=a+bx

a恒定干擾b比例干擾(如,標(biāo)記抗原不純,交叉免疫)2024/7/1936(二)標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量范圍1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立(二)少數(shù)方法(如,IA)外,通常為線性模式線性回歸:最小二乘法或加權(quán)最小二乘法自變量(x)為藥物濃度,因變量(y)為響應(yīng)信號(hào)強(qiáng)度(1)系列標(biāo)準(zhǔn)溶液:

n≥6(不包括0點(diǎn));等比系列(2~3); 通常為100~1000倍(2)內(nèi)標(biāo)溶液:

濃度相當(dāng)于系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的幾何平均濃度

(3)系列標(biāo)準(zhǔn)樣品:空白生物介質(zhì),加入系列標(biāo)準(zhǔn)溶液(4)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:藥物濃度,以單位體積(如血漿)或質(zhì)量(如肝臟)的生物介質(zhì)中加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的量表示2024/7/1937(二)標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量范圍2.限度要求通常用至少6個(gè)濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線非線性相關(guān)(如IA)可能需要更多濃度點(diǎn)定量范圍覆蓋全部待測(cè)樣品濃度范圍定量上限(ULOQ)高于用藥后的峰濃度(Cmax)定量下限(LLOQ)低于Cmax的10%~5%(1/10~1/20)標(biāo)準(zhǔn)曲線各濃度點(diǎn)的回歸計(jì)算值(x’)與標(biāo)示值(x)之間的偏差〔bias=[(x’-x)/x]×100%〕在可接受的范圍之內(nèi)最低濃度點(diǎn)的偏差在±20%以內(nèi)其余濃度點(diǎn)的偏差在±15%以內(nèi)2024/7/1938(三)定量下限1.測(cè)定法取同一生物介質(zhì),制備至少5個(gè)獨(dú)立的標(biāo)準(zhǔn)樣品,其濃度應(yīng)使信噪比(S/N)大于5,依法進(jìn)行精密度與準(zhǔn)確度驗(yàn)證定量下限(LLOQ):標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低濃度點(diǎn)符合準(zhǔn)確度和精密度要求2.限度要求準(zhǔn)確度應(yīng)在標(biāo)示濃度的80%~120%范圍內(nèi),相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)應(yīng)小于20%2024/7/1939(四)精密度與準(zhǔn)確度1.測(cè)定法高中低3個(gè)濃度的QC樣品,制備至少5個(gè)獨(dú)立的樣品低:LLOQ的2~3倍;高:ULOQ的80%;中:幾何平均濃度同法獨(dú)立測(cè)定3天方法精密度除評(píng)價(jià)批內(nèi)(日內(nèi))RSD外,同時(shí)還應(yīng)評(píng)價(jià)批間(日間)RSD2.限度要求準(zhǔn)確度:低,80%~120%; 中高,85%~115%RSD:低,20%; 中高,15%2024/7/1940(五)穩(wěn)定性1.測(cè)定法(高低濃度)室溫考察1個(gè)工作日(如1,2,4,8或24h)

冷藏(4℃)數(shù)個(gè)工作日(標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至整個(gè)分析完成)冷凍(-20℃/-80℃)至整個(gè)分析完成凍-融至少經(jīng)歷3個(gè)循環(huán)短期穩(wěn)定性:在1個(gè)分析批內(nèi),樣品室溫等待處理;處理后溶液在特定(HPLC進(jìn)室)溫度等待進(jìn)樣期間穩(wěn)定性長(zhǎng)期穩(wěn)定性:在整個(gè)樣品分析期間,體內(nèi)樣品的長(zhǎng)期儲(chǔ)藏,凍融;以及標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的穩(wěn)定性2.期限要求短期:通常1工作日,不超過(guò)3工作日;長(zhǎng)期:整個(gè)分析完成期限2024/7/1941(六)提取回收率1.測(cè)定法高中低3個(gè)濃度的QC樣品,制備至少5個(gè)獨(dú)立的樣品另取空白生物介質(zhì),照QC樣品同法處理,加入等量的標(biāo)準(zhǔn)溶液(必要時(shí)除去溶劑)同法處理高中低3個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照樣品(不含生物介質(zhì))樣品處理方法的評(píng)價(jià)重點(diǎn)在于結(jié)果的精密與重現(xiàn);而非待測(cè)物提取的完全與否2.限度要求RSD:低,20%; 中高,15%2024/7/1942(七)分析過(guò)程的質(zhì)量控制每個(gè)未知樣品測(cè)定一次,必要時(shí)進(jìn)行復(fù)測(cè)來(lái)自同一個(gè)體的體內(nèi)樣品在同一分析批中測(cè)定每個(gè)分析批,建立批標(biāo)準(zhǔn)曲線;并隨行3濃度QC樣品

QC樣品每個(gè)濃度至少雙樣本,并均勻分布在未知樣品順序(低→高/高→低順序均勻穿插整個(gè)分析批)中一個(gè)分析批內(nèi)未知樣品數(shù)目較多時(shí),應(yīng)同時(shí)增加各濃度QC樣品數(shù),使QC樣品數(shù)大于未知樣品總數(shù)的5%QC樣品測(cè)定結(jié)果的偏差不大于±15%,低濃度點(diǎn)偏差不大于±20%;允許1/3非同濃度QC樣品結(jié)果超限不符合上述要求,則該分析批樣品測(cè)試結(jié)果作廢2024/7/1943(八)未知樣品濃度超限的處理標(biāo)準(zhǔn)曲線不能外延,濃度超限的樣品處理后再測(cè)定濃度高于ULOQ部分樣品用空白生物介質(zhì)稀釋至規(guī)定體積再測(cè)定同時(shí)制備濃度高于ULOQ的QC樣品,同法稀釋(濃度不低于LLOQ)后測(cè)定濃度低于LLOQ增加樣品體積(制備樣品濃度高于LLOQ);同法進(jìn)行QC樣品和空白介質(zhì)試驗(yàn)特異性不降低,準(zhǔn)確度和精密度符合要求生物利用度/生物等效性研究,不需處理2024/7/1944(九)作為藥用的內(nèi)源性物質(zhì)的測(cè)定

對(duì)生物介質(zhì)進(jìn)行處理 生物介質(zhì)通過(guò)活性炭濾過(guò)、透析等技術(shù)去除所含的該內(nèi)源性物質(zhì)后,作為空白生物介質(zhì)使用使用特定生物周期階段的生物介質(zhì)

適用于呈周期性變化的內(nèi)源性物質(zhì)(如雌激素)使用替代介質(zhì)

如兔血漿,人血清蛋白,緩沖液,0.9％氯化鈉溶液等;測(cè)得的濃度需進(jìn)行校正采用標(biāo)準(zhǔn)加入法適用于內(nèi)源性物質(zhì)含量較低的藥物;結(jié)果為總濃度2024/7/1945(十)微生物學(xué)/免疫學(xué)方法的驗(yàn)證微生物學(xué)或免疫學(xué)分析法的標(biāo)準(zhǔn)曲線本質(zhì)上是非線性的,應(yīng)盡可能采用更多的濃度點(diǎn)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線如果重復(fù)測(cè)定能夠改善準(zhǔn)確度,則應(yīng)在方法驗(yàn)證和未知樣品測(cè)定中采用同樣的步驟(如雙樣本分析)微生物學(xué)或免疫學(xué)分析方法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)應(yīng)包括在幾天內(nèi)進(jìn)行的6個(gè)分析批,每個(gè)分析批應(yīng)包括4個(gè)濃度(LLOQ、低、中、高濃度)的質(zhì)控雙樣本2024/7/1946(十一)名詞解釋1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(referencestandard):用于制備標(biāo)準(zhǔn)樣品和QC樣品的待測(cè)物的參比標(biāo)準(zhǔn)在結(jié)構(gòu)上可以是待測(cè)物本身,也可以是其游離堿或酸,鹽或酯常用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)主要有三種來(lái)源:①法定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(如ChP標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌?