實時活細(xì)胞分析開啟免疫細(xì)胞殺傷實驗新格局

活細(xì)胞分析、細(xì)胞毒性T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、免疫細(xì)SR正OZIUS在理解癌癥并開發(fā)新治療策略的持續(xù)不斷的研究中，研究人員正在探索患者的自身免疫系統(tǒng)在抵御腫瘤時發(fā)揮的作用。這種抗癌反應(yīng)的一個關(guān)鍵組成部分是某些免疫細(xì)胞（如細(xì)胞毒性T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞）通過免疫細(xì)胞殺傷（ICK）過程誘導(dǎo)惡傳統(tǒng)上有多種用于評估ICK的技術(shù)，如流式細(xì)胞術(shù)及生化讀數(shù)。雖然這些都是有效的手段，但它們只能從單個時間點的分析中得出測量結(jié)果，并不能對動態(tài)細(xì)胞相互作用進行表征，從而限制了可獲得的生物學(xué)見解。因此，為了更全面地了解ICK，科學(xué)家們非常需要一些能夠捕捉、可視化并量化ICK相關(guān)動態(tài)變化的方法。此外，隨著轉(zhuǎn)化模型的應(yīng)用越來越廣泛，研究人員需要一些可應(yīng)用于3D腫瘤球體以及貼壁和非貼壁2D共培養(yǎng)物的靈活I(lǐng)CK分析方法。本白皮書展示了實時活細(xì)胞分析技2鑒于ICK的復(fù)雜性，研究人員在體外模擬這個流程時也會在共培養(yǎng)模型中測定細(xì)胞特異性細(xì)胞毒性信號。例如，使法確定信號是否來自共培養(yǎng)模型中的腫瘤細(xì)胞或免疫細(xì)胞胞特異性信號。然而，背景信號仍然會限制從該分析中得即使對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性進行最可靠的分析，這種細(xì)胞死亡的總體指標(biāo)也無法反映ICK中復(fù)雜細(xì)胞相互作用的微妙之處。舉個例子，不同的T細(xì)胞亞群在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡時可能會發(fā)揮不同的功能作用。3探索這些行為差異的研究人員就需要研究激活的免疫細(xì)胞的形態(tài)特征以及其與癌細(xì)胞的空間關(guān)系。然而，用于評估ICK的傳統(tǒng)方法并不是基于影像的，通常需要取出細(xì)胞。因此，科學(xué)家需要采用補充性技術(shù)，以便在這一動態(tài)過程中對表型和空間有深入除了難以獲得可靠且全面的數(shù)據(jù)外，傳統(tǒng)的分析方法還缺乏充分表征ICK過程所需要的時間分辨率。由于大多數(shù)方法是在預(yù)先確定的終點進行參數(shù)評估，因此無法深入了解生物學(xué)中的動態(tài)變化。4另外一個問題是收集數(shù)據(jù)時細(xì)胞成熟度和健康狀況的可變性，這可能會限制結(jié)果的質(zhì)量和可此外，當(dāng)發(fā)現(xiàn)問題時，排除問題以確定問題原因可能會涉及反復(fù)的實驗運行，這會消耗寶貴的材料，并可能要花費隨著細(xì)胞培養(yǎng)模型變得越來越復(fù)雜，與ICK測定相關(guān)的挑戰(zhàn)也變得更加難以克服。這是免疫腫瘤學(xué)研究中亟待解決的一個問題，因為科學(xué)家們經(jīng)常需要從簡單的2D培養(yǎng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)向更具生理相關(guān)性的先進3D模型。例如，越來越多的腫瘤球體模型被用于揭示腫瘤微環(huán)境（TME）如何影響癌癥和免疫應(yīng)答之間的相互作用。5、6作為獲得更多轉(zhuǎn)化見解的進一步策略，許多研究人員現(xiàn)在正在將活檢組織或嵌合抗原受體（CAR）T細(xì)胞等患者來源的材料納入ICK模型，這可能有助于釋放個體化用藥的全部潛力。在這種不斷擴大的轉(zhuǎn)化細(xì)胞研究領(lǐng)域，科學(xué)家們也在不斷尋求可適應(yīng)一這些轉(zhuǎn)化模型所涉及的復(fù)雜培養(yǎng)物也越來越精細(xì)。因此，它們更容易受到環(huán)境條件變化的影響，進而使其在技術(shù)上很難獲得可靠的結(jié)果。但是，由于這些脆弱的培養(yǎng)物比細(xì)研究人員認(rèn)識到需要新的ICK方法來更好地監(jiān)測細(xì)胞，并提供多用途功能，以便從盡可能少的材料中提取最多的信息。對于希望滿足這些要求的科學(xué)家來說，活細(xì)胞分析是活細(xì)胞分析可利用實時成像來實時捕捉活細(xì)胞的行為。將培養(yǎng)物保存在培養(yǎng)箱內(nèi)的成像平臺上，以在整個實驗過程中實時觀察生物事件和行為的動態(tài)變化。因此，科學(xué)家可以在最合適的時候持續(xù)評估培養(yǎng)物并安排操作及測定。這種靈活性對研究人員來說是一個關(guān)鍵的優(yōu)勢，因為他們要應(yīng)對不同培養(yǎng)物之間的生物差異，尤其是需要最大限度地活細(xì)胞分析技術(shù)可用于測定包括2D和3D培養(yǎng)物在內(nèi)的各））抗體或磁珠激活。更常見的是，腫瘤細(xì)胞將用可作為增殖標(biāo)記物定量的核限制熒光蛋白標(biāo)記，而細(xì)胞凋亡將在第二個熒光通道中用試劑來測定，例如Incucyte?Caspase3/73或AnnexinV染料。為了減輕免疫細(xì)胞凋亡對結(jié)果的影響，采用尺寸篩選過濾器設(shè)置來排除較小的效應(yīng)細(xì)胞，從而減成像平臺也設(shè)在培養(yǎng)箱中，因此在整個分析過程中細(xì)胞都不會受到干擾。這對于需要穩(wěn)定環(huán)境的精細(xì)培養(yǎng)物來說是為了說明活細(xì)胞分析對ICK測定的價值，將Incucyte?Nuclight細(xì)胞核紅色熒光蛋白標(biāo)記的A549腫瘤細(xì)胞（2000綠色染料，用以測定細(xì)胞凋亡情況。在選定的孔中加入抗胞核）計數(shù)評估靶細(xì)胞的增殖情況，使用綠色對象計數(shù)對4433112334實時圖像可以捕捉形態(tài)腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡情況則可以通過圖像分析進行量化。3腫瘤細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)顆粒形成后立即進行），3000A549100004003002001000圖1：使用活細(xì)胞分析在簡單的2D共培物模型中評估免疫細(xì)胞殺傷情況。(A)免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞間相互作用的可視化。(B)腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡的實時定量。分析圖像中的紅色對象計數(shù)，以評估腫瘤細(xì)胞增殖情況，分析圖對象計數(shù)，評估腫瘤細(xì)胞凋亡情況。T細(xì)胞被激活的孔分析從這些孔中獲得的圖像清楚地表明免疫細(xì)胞和T細(xì)胞之間的相互作用，說明了T細(xì)胞攻擊后是胞質(zhì)粒化和Incucyte?Caspase3/7標(biāo)記的過程。除了靜態(tài)圖像之外，還可視頻來完整地捕捉ICK過程。這些豐富的視頻數(shù)據(jù)不僅便于研究人員從中收集豐富的生物信息，也可能為故障排除上述研究證明，活細(xì)胞分析的基本用途是獲得腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡的總體指標(biāo)，并為顯示細(xì)胞類型之間相互作用提4隨著活細(xì)胞分析能力的進步，科學(xué)家們獲得了新的技能來算法來定義單個細(xì)胞。因此，科學(xué)家現(xiàn)在可以使用細(xì)胞圈的所有細(xì)胞，而不是簡單地使用紅色對象計數(shù)來量化腫瘤細(xì)胞。由于腫瘤細(xì)胞用RFP標(biāo)記，因此可以根據(jù)是否存在這種用于區(qū)分不同細(xì)胞類型的技能也有幾個優(yōu)勢。首先，研究人員可以在不使用標(biāo)記物的情況下就識別出效應(yīng)細(xì)胞。其次，科學(xué)家可以在涉及非貼壁靶細(xì)胞的研究中優(yōu)化細(xì)胞分類。這些腫瘤細(xì)胞可能看起來與免疫細(xì)胞非常相似，因此很難通過標(biāo)準(zhǔn)分析中使用的尺寸篩選法從干擾的效應(yīng)細(xì)為了說明細(xì)胞圈描軟件在非貼壁培養(yǎng)中的使用，將Incucyte?Nuclight細(xì)胞核紅色熒光蛋白標(biāo)記的Ramos細(xì)胞（10000個細(xì)胞/孔）與越來越多的預(yù)活化或非活化的PBMC混合，并加入Incucyte?AnnexinV綠色染料作為凋件模塊內(nèi)的高級圖像處理算法來圈描單個細(xì)胞，然后根據(jù)是否存在紅色熒光將其分為靶細(xì)胞群和效應(yīng)細(xì)胞群。隨著效應(yīng)細(xì)胞數(shù)量的增加，靶細(xì)胞群（紅色）的增殖減少，凋亡增加。相比之下，效應(yīng)細(xì)胞群（非紅色）隨著時間的推圖像分析軟件的進步也讓科學(xué)家得以可視化并量化免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞之間的相互作用。例如，通過對兩個細(xì)胞圈描的重合或重疊進行定量，即可以評估免疫和靶細(xì)胞的相互作用。為了證明這一點，在加入Incucyte?Fabfluor-488-α-CD45和Incucyte?Opti將Incucyte?Cytolight細(xì)胞質(zhì)紅色熒光蛋白標(biāo)記的A549腫瘤細(xì)胞（5000個細(xì)胞/孔）與預(yù)活化或未活化的PBMC（25000個細(xì)胞/孔，T:E比率為1:5）一起培養(yǎng)，用以標(biāo)記總淋巴細(xì)胞群（圖3）。加入PBMC兩個小時后，使用圖像處理軟件圈描細(xì)胞，以便對靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞的空間信息定量。與預(yù)期一致，結(jié)果顯示活化的PBMC與靶細(xì)胞5100100 00244872604040202004800480++++500244872 于紅色熒光區(qū)分靶細(xì)胞（藍(lán)色）和效應(yīng)細(xì)胞（黃色）亞群。(B)根據(jù)紅色和綠色熒光對亞群進行分類。(6CD45，非活化PBMCCD45，預(yù)活化PBMC覆蓋面積x覆蓋面積x1052/孔)06040200圖3：免疫和腫瘤細(xì)胞相互作用的可視化和量化科學(xué)家可通過測定和量化細(xì)胞間的相互作用，以獲得更多的形態(tài)學(xué)和空間見解，從而更好地表征ICK過程。最終，這些信息可為新型候選療法的鑒別提供支持。例如，評估細(xì)胞相互作用的持續(xù)時間可能對藥物研發(fā)項目非常有價值，因為免疫細(xì)胞和癌細(xì)胞之間接觸時間的延長可能與ICK的增強式圖像處理的另一個應(yīng)用是使用特定于表面標(biāo)記物的特異性抗體來獨立評估不同的效應(yīng)細(xì)胞亞型。這種亞型分析與相互作用評估結(jié)合在一起，便于科學(xué)家確定與靶細(xì)胞相互作用的免疫細(xì)胞群。因此，這種方法可以將對小部分細(xì)胞的強治療效果及對所有細(xì)胞的較差治療效果區(qū)分開來。由于不同效應(yīng)細(xì)胞類型之間的異質(zhì)性是免疫腫瘤學(xué)藥物發(fā)現(xiàn)中的主要復(fù)雜因素，所以，這些新功能與基于整合所有越來越多的證據(jù)強調(diào)組織環(huán)境和結(jié)構(gòu)在調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞之間的復(fù)雜關(guān)系中的重要性。因此，在體外評估癌癥免疫治療藥物時，許多科學(xué)家都會使用3D多生理相關(guān)的數(shù)據(jù)。事實上，已有證據(jù)表明，3D培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞可以表現(xiàn)出更強的抗細(xì)胞毒性，這也更能反映出體內(nèi)情況。6腫瘤球模型結(jié)合了由癌細(xì)胞構(gòu)成的3D細(xì)胞聚體，可提供一種反映3DTME的有力方法，因為它們會模擬細(xì)胞間接觸使用單一球狀體，這是一種可以通過將腫瘤細(xì)胞接種在超低附著板中而形成的聚集體。這為可能存在缺氧核心的實為了證明單一球狀體模型在評估ICK中的作用，將Incucyte?Nuclight細(xì)胞核紅色熒光蛋白標(biāo)記的A549腫瘤細(xì)胞接種于圓底96孔板（2500個細(xì)胞/孔）中，并在三況下共同培養(yǎng)。然后使用Incucyte?HD相位和熒光圖像監(jiān)測球體在幾天內(nèi)的生長狀況。結(jié)果顯示，在有活化PBMC的情況下，球狀體的熒光強度會顯著降低，而這表明腫瘤第0天+Anti-CD3/IL-2(10ng/mL)第0天30僅A54920+AntiCD3/IL-20圖4：活化PBMC對腫瘤球體增殖的影響。(A)高清相瘤球體增殖的影響。在有活化PBMC時，熒光強度明顯降低。(B)時間進程圖顯示了球狀體8包含細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）成分的多球體模型為免疫腫瘤學(xué)因為它可以影響細(xì)胞間的相互作用，進而影響免疫細(xì)胞在3D結(jié)構(gòu)中的滲透。在多球體模型中，生物基質(zhì)會改變球體5為此類研究的示例。該分析評估了赫賽汀對Her2陽性細(xì)胞的抗體依賴性細(xì)胞毒性（ADCC）。將穩(wěn)定表達(dá)RFP的Her2陰性MCF-7細(xì)胞（Incucyte?Nuclight細(xì)胞核紅色熒光蛋白標(biāo)記的MCF-7）或穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞質(zhì)綠色熒光蛋白的光蛋白標(biāo)記的BT-474）接種在平底96/孔）中的Matrigel?基底上。培養(yǎng)三天以形成多球體，然后在有或無PBMC（5000個七天里，使用明場和熒光圖像來監(jiān)測球狀體。結(jié)果表明，只有在Her2陽性的BT-474細(xì)胞中存在赫賽汀的情況下，熒光出現(xiàn)濃度依賴性丟失，而在Her2陰性的MCF-7細(xì)胞中沒有出現(xiàn)這種現(xiàn)象。在加入活化T細(xì)胞群（抗CD3和Incucyte?NuclightRedMCF-7100Incucyte?CytolightGreenBT-474Incucyte?NuclightRedMCF1002/圖像)60600.041502550250log[赫賽汀]μg/mL圖5：赫賽汀誘導(dǎo)的PBMC對多球體增殖的影響。(A)七天內(nèi)（Incucyte?NuclightRedMCF-7）或十天內(nèi)（Incucyte?CytolightGreenBT-474）拍攝的Incucyte?明場和熒光圖像顯示了在無（上圖）和有（下圖）PBMC的情況下，赫賽汀對球體增殖的影響。明場輪廓圈描以黃色顯示。(B)時間進程9為了更好地理解ICK過程，科學(xué)家們正在通過更復(fù)雜的轉(zhuǎn)化模型來尋求更深入的生物學(xué)見解。到目前為止，我們提供的證據(jù)表明，活細(xì)胞分析可以很容易地用于這項研究。隨著免疫學(xué)研究領(lǐng)域的不斷發(fā)展，這項技術(shù)也有可能應(yīng)用多重培養(yǎng)：活細(xì)胞分析可用于涉及三種或三種以上細(xì)胞類型的多重培養(yǎng)。鑒于越來越多的證據(jù)表明基質(zhì)細(xì)胞相互作用在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮著重要的作用，這種模型可能會被越來越多地用于免疫腫瘤學(xué)研究。9對于需要在這些復(fù)雜模型另一個關(guān)鍵的轉(zhuǎn)化方法是將活檢組織或CAR-T細(xì)胞等來源于患者的材料納入ICK分析。同樣，活細(xì)胞分析也可輕松事實上，這種