紅托竹蓀液體菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程

ICSFORMTEXT點(diǎn)擊此處添加ICS號FORMTEXT點(diǎn)擊此處添加中國標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn)分類號FORMTEXT?????DBFORMTEXT52DBFORMTEXT/FORMTEXTTXXXXX—FORMTEXTXXXXFORMTEXT?????FORMTEXT紅托竹蓀液體菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程FORMTEXTTechnicalinspectionofliquidspawnofPhallusrubrovolvatusFORMTEXT點(diǎn)擊此處添加與國際標(biāo)準(zhǔn)一致性程度的標(biāo)識FORMDROPDOWNFORMTEXT（本稿完成日期：2020.10.28）FORMTEXT????-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX發(fā)布FORMTEXT????-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX實(shí)施FORMTEXT?????貴州省市場監(jiān)督管理局???發(fā)布DBXX/XXXXX—XXXX前??言本文件參照GB/T1.1-2009《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫》的規(guī)定起草。給出的規(guī)則起草。本文件由貴州省農(nóng)作物品種資源研究所提出。本文件由貴州省食用菌標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本文件起草單位：貴州省農(nóng)作物品種資源研究所、貴州省納雍縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局本文件主要起草人：桂陽、黃萬兵、朱國勝、劉宏宇、盧穎穎、龔光祿、楊通靜、張軍、王沁、胡騰文DBXX/XXXXX—XXXX紅托竹蓀液體菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程范圍本文件規(guī)定了紅托竹蓀（紅托鬼筆）（Phallusrubrovolvatus(M.Zang,D.G.Ji&X.X.Liu)Kreisel）液體菌種生產(chǎn)術(shù)語和定義、生產(chǎn)技術(shù)要求、液體菌種生產(chǎn)工藝與流程、記錄與存檔、貯藏等。本文件適用于紅托竹蓀液體菌種的生產(chǎn)。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB150.2壓力容器—第二部分:材料GB5749生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB50073潔凈廠房設(shè)計(jì)規(guī)范NY/T528食用菌菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程N(yùn)Y/T1742食用菌菌種通用技術(shù)要求術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1液體菌種liquidspawn 用于生產(chǎn)和銷售的菌絲體及其生長基質(zhì)組成的液體繁殖材料，包括搖瓶液體菌種、發(fā)酵罐菌種。3.2液體菌種發(fā)酵罐cultivationapparatusforliquidspawn指進(jìn)行液體菌種培養(yǎng)的專用設(shè)備，符合GB150.2要求。3.3液體菌種接種器liquidinterfacetrapinoculator指能將液體菌種從培養(yǎng)器中按無菌操作要求轉(zhuǎn)接到固體培養(yǎng)基物料上的設(shè)備。3.4固體專用種solidspecialspawn指在玻璃試管/平皿上固體培養(yǎng)基內(nèi)生長的純菌絲體培養(yǎng)物，專供接入液體培養(yǎng)基使用。生產(chǎn)技術(shù)要求液體菌種生產(chǎn)廠房4.1.1液體菌種生產(chǎn)場所要求生產(chǎn)場所符合NY/T528的環(huán)境要求。液體菌種生產(chǎn)場址應(yīng)建在交通方便，水源和電源充足，無有害氣體、煙霧、灰沙，遠(yuǎn)離垃圾場、畜禽場舍等有污染的地方，有硬質(zhì)路面且排水良好的道路。4.1.2廠房要求廠房設(shè)計(jì)應(yīng)符合NY/T528的要求，增設(shè)搖瓶菌種培養(yǎng)室、發(fā)酵罐菌種培養(yǎng)室。4.1.3液體菌種生產(chǎn)車間要求液體菌種生產(chǎn)廠房設(shè)計(jì)達(dá)到GB50073要求。液體菌種生產(chǎn)車間地面應(yīng)能防水、防滑、防腐蝕、防滲漏、易清洗，有適當(dāng)?shù)呐潘露龋?.0%～1.5%）和良好的排水系統(tǒng)，排水溝必須是圓弧式的明溝。墻壁和天花板應(yīng)能防潮、防霉、防水、易清洗。門窗應(yīng)設(shè)置防蚊蠅紗網(wǎng)。車間入口處應(yīng)設(shè)置洗手、消毒和干手設(shè)施。車間安裝排氣管道、進(jìn)水管道、蒸汽管道、熱水循環(huán)管道或者排風(fēng)設(shè)備，設(shè)封閉式廢物桶。液體菌種接種間應(yīng)設(shè)置緩沖間。滅菌間、冷卻間、培養(yǎng)間符合NY/T528要求。生產(chǎn)設(shè)備與設(shè)施4.1.1主要生產(chǎn)設(shè)備包括液體菌種發(fā)酵罐、空氣壓縮機(jī)、高效空氣過濾器、液體菌種接種器、高壓蒸汽滅菌鍋、蒸汽鍋爐、凈化工作臺、恒溫?fù)u床、恒溫培養(yǎng)箱、除濕機(jī)、自備電源（發(fā)電機(jī)）等。液體菌種發(fā)酵罐、高壓滅菌鍋和蒸汽鍋爐應(yīng)符合GB150.2要求；高效空氣過濾器：對粒徑0.1μm～0.2μm粒子的捕集效率在99.999%以上，且所有材質(zhì)應(yīng)耐126℃高溫滅菌。4.1.2主要基本設(shè)施液體菌種生產(chǎn)車間應(yīng)包含配料間、滅菌室、冷卻間、接種間、培養(yǎng)間、發(fā)酵間、化驗(yàn)室、菌種室等，其規(guī)模要配套，布局合理，要有調(diào)溫設(shè)施?；?yàn)室有相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)檢測設(shè)備，菌種室有滅菌設(shè)施和常規(guī)用具。培養(yǎng)原料應(yīng)符合NY/T528要求，生物制劑及天然材料水不溶物物料應(yīng)過100目篩。4.4菌種選擇選用高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆性強(qiáng)、商品性好的紅托竹蓀品種，生產(chǎn)質(zhì)量符合NY/T1742的要求。引種的品種須進(jìn)行適應(yīng)性出菇試驗(yàn)驗(yàn)證。液體菌種生產(chǎn)工藝流程紅托竹蓀液體菌種生產(chǎn)工藝流程見圖1。放罐放罐發(fā)酵罐搖瓶固體專用種配料分裝滅菌冷卻配料分裝滅菌冷卻檢驗(yàn)檢測15-25天液體菌種液體菌種檢查搖瓶菌種10-15天攪拌

攪拌

圖1紅托竹蓀液體菌種生產(chǎn)工藝流程搖瓶液體菌種生產(chǎn)技術(shù)5.1液體培養(yǎng)基配方及制作5.1.1液體培養(yǎng)基配方見附錄A。5.1.2分裝搖瓶液體培養(yǎng)基分裝量為不超過搖瓶容積的60%。5.1.3滅菌液體培養(yǎng)基配制分裝后應(yīng)立即滅菌。滅菌條件：0.120MPa～0.140MPa、溫度達(dá)121℃時(shí)，高壓蒸汽滅菌30min～40min。5.1.4冷卻冷卻間使用前要進(jìn)行清潔和除塵處理。將滅菌后搖瓶液體培養(yǎng)基放置在冷卻間中，冷卻到液體培養(yǎng)基降溫至室溫（≤25℃）。5.2接種在凈化工作臺上嚴(yán)格按無菌操作規(guī)程，將合格的紅托竹蓀固體專用種接種，用接種針挑取3～5塊（4mm×4mm～5培養(yǎng)5.3.1培養(yǎng)條件在使用培養(yǎng)室的前兩天，采用藥物或者紫外燈消毒。搖瓶液體菌種應(yīng)置于搖床上震蕩培養(yǎng)，震蕩頻率120r/min～125r/min，振幅6cm～10cm，恒溫25℃，培養(yǎng)時(shí)間12d～5.3.2培養(yǎng)期檢查搖瓶液體菌種培養(yǎng)期間應(yīng)定期檢查和記錄，及時(shí)揀出不合格菌種，并應(yīng)及時(shí)留樣用于檢驗(yàn)。發(fā)酵罐菌種生產(chǎn)技術(shù)空氣過濾器的檢查與滅菌6.1.1檢查使用前應(yīng)拆分檢查空氣過濾器濾芯，要求無油污、料污、無破損，外殼內(nèi)外壁要求無污物、光亮潔凈。6.1.2滅菌對檢查后的空氣過濾器高壓蒸汽滅菌，滅菌條件：0.120MPa～0.140MPa、溫度達(dá)121℃時(shí)，高壓蒸汽滅菌30min～40min。發(fā)酵罐檢查與清洗6.2.1檢查檢查罐上的全部閥門、安全閥、壓力表，要求完好，工作正常。6.2.2清洗用流水沖洗罐體內(nèi)、外和全部閥門，到達(dá)內(nèi)壁無任何培養(yǎng)料殘余物，無死角的潔凈程度。6.2.3空消發(fā)酵罐初次使用、出現(xiàn)染菌、長期放置、更換品種時(shí)，都要求利用外源蒸汽空消進(jìn)行滅菌。滅菌條件：發(fā)酵罐罐體壓力0.120MPa～0.140MPa、溫度達(dá)121℃時(shí)，高壓蒸汽滅菌30min～40min。發(fā)酵罐菌種培養(yǎng)基要求與制作6.3.1原料要求發(fā)酵罐菌種培養(yǎng)基原料應(yīng)符合NY/T528要求，同時(shí)水不溶物物料應(yīng)過100目篩。用水符合GB5749要求。6.3.2培養(yǎng)基配方配方見附錄Ａ。6.3.3投料與定容將配制好的液體培養(yǎng)基原料充分溶解，加適量溫水?dāng)嚢杈鶆?，倒入或用泵抽入發(fā)酵罐中，加水定容至所需體積（液體培養(yǎng)基占罐體總?cè)莘e不超過80%）。裝料時(shí)保持進(jìn)氣管壓0.10MPa～0.15MPa，通氣鼓動(dòng)液體基料，使料混勻，至滅菌料溫上升到90℃時(shí)，關(guān)閉進(jìn)氣管通氣。清理加料口，不應(yīng)用殘留的物料，擰緊上料口蓋。6.3.4發(fā)酵罐實(shí)消投料定容完成后，利用外源蒸汽實(shí)消滅菌。滅菌條件：發(fā)酵罐罐體壓力0.120MPa～0.140MPa、培養(yǎng)基溫度達(dá)到121℃時(shí)，高壓蒸汽滅菌30min～40min（發(fā)酵罐容積100L～1000L），應(yīng)防止滅菌死角。6.3.5冷卻和調(diào)壓實(shí)消滅菌結(jié)束后將冷水通入發(fā)酵罐夾層或者內(nèi)置冷卻系統(tǒng)中循環(huán)，使液體培養(yǎng)基降溫至24℃～26℃。降溫過程中當(dāng)壓力降到0.05MPa時(shí)，及時(shí)向發(fā)酵罐內(nèi)通無菌空氣防止罐壓回零，并維持壓力到0.02MPa～0.04MPa。接種利用火焰保護(hù)接種法。把火圈放在投料口的上方點(diǎn)燃，此時(shí)打開進(jìn)料口蓋，把搖瓶液體菌種迅速投入罐中（接種量的體積比為1%～3%），迅速蓋好進(jìn)料口蓋、擰緊。移走火焰圈，液體菌種進(jìn)入培養(yǎng)階段。發(fā)酵罐菌種培養(yǎng)條件培養(yǎng)時(shí)控制進(jìn)氣閥的無菌空氣通風(fēng)量至1m3/h（發(fā)酵罐容積100L～1000L）、罐壓保持在0.02MPa～0.04MPa之間、培養(yǎng)溫度24℃～25℃內(nèi)。培養(yǎng)12d～15d后，發(fā)酵罐菌種即可達(dá)到放罐指標(biāo)。留樣及檢測留樣紅托竹蓀固體專用種應(yīng)留樣備查，留樣的數(shù)量應(yīng)以每個(gè)批號3支~5支或皿，于4℃~6℃下貯存，貯存至經(jīng)轉(zhuǎn)接的栽培袋正常發(fā)菌。每個(gè)批號搖瓶菌種取1mL裝于2mL的凍存管，留存12支。每個(gè)批號發(fā)酵罐滅菌后的空白培養(yǎng)基取樣取1mL裝于2mL的凍存管，留存12支；每個(gè)批號放罐前48h從發(fā)酵罐中取1mL裝于2mL的離心管，留存12支；每個(gè)批號發(fā)酵終止后取樣取1mL裝于2mL的凍存管，留存12支6.6.2無菌檢測搖瓶液體菌種樣品、發(fā)酵罐滅菌后的空白培養(yǎng)基樣品應(yīng)在無菌檢測瓊脂平板上25℃恒溫培養(yǎng)2d～5d，及時(shí)觀察有無細(xì)菌、霉菌、酵母菌等雜菌生長。培養(yǎng)過程中定期從發(fā)酵罐中取出的樣品應(yīng)及時(shí)鏡檢與無菌檢測，同時(shí)確定菌絲生長發(fā)育狀態(tài)與排除雜菌污染。發(fā)酵罐菌種放罐指標(biāo)6.6.1菌種感官指標(biāo)發(fā)酵罐菌種感官指標(biāo)符合表1的要求表1感官指標(biāo)項(xiàng)目指標(biāo)菌液色澤菌絲球呈白色，菌液呈淡黃色，澄清透明。菌液形態(tài)菌液稍粘稠，菌絲體稠密，菌絲球均勻懸浮于液體中，不分層。菌液氣味濃烈的菌香味，無酸、臭味異味。發(fā)酵罐排氣口氣味正常，無明顯改變。6.6.2菌種理化指標(biāo)發(fā)酵罐菌種理化指標(biāo)見表2表2理化指標(biāo)項(xiàng)目指標(biāo)pH值3.0-4.0菌絲濕重（g／100ml）＞7顯微鏡下菌絲形態(tài)和雜菌鑒別可見紅托竹蓀蓀菌種液體培養(yǎng)中特有的菌絲形態(tài)，球狀和叢狀菌絲體大量分布，菌絲粗壯。無霉菌菌絲、酵母和細(xì)菌菌體。留存樣品無菌檢查平板有紅托竹蓀菌絲生長，無霉菌、酵母菌、細(xì)菌等雜菌生長。貯藏紅托竹蓀液體菌種生產(chǎn)后應(yīng)立即使用。如不能立即使用，需要貯藏發(fā)酵罐內(nèi)持續(xù)通無菌空氣保持罐壓0.02MPa～0.04MPa，常溫下可保存1d運(yùn)輸不宜長途運(yùn)輸。記錄和存檔發(fā)酵罐菌種生產(chǎn)的每個(gè)環(huán)節(jié)都要有詳實(shí)的生產(chǎn)記錄，由具體操作人員現(xiàn)場記錄填寫，定期由主管領(lǐng)導(dǎo)審核，簽字后歸檔保存，至少兩年。

（資料性附錄）

紅托竹蓀液體菌種培養(yǎng)基配方A．紅托竹蓀液體菌種培養(yǎng)基配方紅托竹蓀液體菌種培養(yǎng)基配方包括但不限于：葡萄糖5g、果糖25g、蛋白胨5g、、酵母粉1g、硫酸銨2