(高清版)GB∕T 38484-2020 植物激素類次生代謝產(chǎn)物的生物活性測定 細胞學評價法

ICS07.080植物激素類次生代謝產(chǎn)物的生物活性測定細胞學評價法國家市場監(jiān)督管理總局國家標準化管理委員會IGB/T38484—2020本標準按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標準由中國標準化研究院提出并歸口。1GB/T38484—2020植物激素類次生代謝產(chǎn)物的生物活性測定細胞學評價法本標準規(guī)定了用細胞學評價法測定植物激素類次生代謝產(chǎn)物生物活性的方法。下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法3.1.1來自植物自身合成的以及通過微生物發(fā)酵或化學合成獲得的具有調(diào)控植物生長、發(fā)育與休眠的活3.1.2生物活性biologyactivity單位濃度的植物激素類次生代謝產(chǎn)物與其相對應的標準物促進或抑制植物生長、發(fā)育與休眠能力下列縮略語適用于本文件。4-MU:4-甲基傘形酮(4-methylumbelliferon)AuxRE::GUS:生長素響應gus報告基因(auxin-responsivegusreportergene)CTKRE::GUS:細胞分裂素響應gus報告基因(cytokinin-responsivegusreportergene)DPBS:Dulbecco's磷酸緩沖鹽溶液(Dulbecco'sPhosphate-BufferedSaline)GA?:赤霉酸(gibberellicacid)GARE::GUS:赤霉素響應gus報告基因(gibberellin-responsivegusreportergene)NAA:萘乙酸(1-naphthylaceticacid)ZT:玉米素(zeatin)2GB/T38484—2020植物激素類活性物質(zhì)通過與相應的激素受體結合可調(diào)節(jié)相關蛋白與其靶基因啟動子中的激素應答元件結合進而誘導或抑制靶基因表達。選用攜帶激素響應的gus報告基因的轉基因擬南芥原生質(zhì)體細胞為試驗材料，以標準物為參照，根據(jù)GUS酶活和標準物濃度對數(shù)的線性回歸關系得到標準曲線，計算在線性范圍內(nèi)誘導產(chǎn)生的GUS酶活相同的標準物濃度與試樣濃度的比值，表示單位濃度(mg/mL)試樣所具有的植物激素類次生代謝產(chǎn)物的生物活性。其中GUS蛋白可水解4-MUG為4-MU,由此以37℃水浴條件下每微克GUS蛋白每分鐘水解4-MUG產(chǎn)生的4-MU的物質(zhì)的量來指示5.2AuxRE::GUS細胞系。擬南芥(Arabidopsisthaliana)Columbia(Col-0)生態(tài)型，含有生長素應答元件AuxREs,攜帶單拷貝gus基因，活細胞數(shù)≥1×10?個/mL。5.3GARE::GUS細胞系。擬南芥(Arabidopsisthaliana)Columbia(Col-0)生態(tài)型，含有赤霉素應答元件TATC-boxs,攜帶單拷貝gus基因，活細胞數(shù)≥1×10?個/mL。5.4CTKRE::GUS細胞系。擬南芥(Arabidopsisthaliana)Columbia(Col-0)生態(tài)型，含有細胞分裂素應答元件ARR1AT,攜帶單拷貝gus基因，活細胞數(shù)≥1×10?個/mL。5.5細胞系培養(yǎng)液。不含蔗糖和瓊脂的MS培養(yǎng)基4.74g,加950mL水溶解后，加入30.00g蔗糖，0.75g氯化鈣，0.35g硝酸鉀，充分混勻后用氫氧化鈉調(diào)整pH至5.60,加水定容至1000mL,0.22μm水定容至1000mL,混勻后常溫保存?zhèn)溆?。可使用同類商品化產(chǎn)品。醚，用DPBS溶解并定容至1000mL,混勻后常溫保存?zhèn)溆谩?.8含1mmol/L4-MUG的抽提液。稱量105.6mg4-MUG,用抽提液溶解并定容至300mL,現(xiàn)配5.90.2mg/mL牛血清蛋白溶液。稱量20.0mg牛血清蛋白標準品，用DPBS溶解并定容至100mL,5.10反應終止液。稱取21.20gNa?CO?,用水溶解并定容至1000mL。5.11考馬斯亮藍染色液。稱取0.5g考馬斯亮藍G-250,溶于50mL90%的乙醇中，并加入DPBS100mL,用水定容至1000mL,混勻后常溫保存。有效期一個月。5.1210μmol/L4-MU母液。稱取17.6mg4-MU,用反應終止液溶解并定容至10mL,混勻，得到200nmol/L的4-MU使用液。然后吸取1mL200nmol/L的4-MU,加入1mL反應終止液，混勻后得4-MU使用液。3GB/T38484—20205.14NAA。純度≥98%。5.15GA?。純度≥98%。5.16ZT。純度≥98%。2×10-1mg/mLNAA溶液。依次10倍稀釋得2.00×10-?mg/mL、2.00×10-?mg/mL、2.00×10-?mg/NAA標準工作液。吸取632μL1mg/mLNAA標準貯備液，368μL細胞系培養(yǎng)液，混勻，得6.32×10-1mg/mLNAA溶液。依次10倍稀釋得6.32×10-?mg/mL、6.32×10-?mg/mLNAA標準2×10-1mg/mLGA?溶液。依次10倍稀釋得2.00×10-?mg/mL、2.00×10-?mg/mL、2.00×10-?mg/mLGA?標準工作液。吸取632μL1mg/mLGA?標準貯備液，368μL細胞系培養(yǎng)液，混勻，得6.32×10-1mg/mLGA?溶液。依次10倍稀釋得6.32×10-?mg/mL、6.32×10-?mg/mLGA?標準5.22ZT標準工作液。吸取200μL1mg/mLZT標準貯備液，800μL細胞系培養(yǎng)液，混勻，得2×10-1mg/mLZT溶液。依次10倍稀釋得2.00×10-3mg/mL、2.00×10-?mg/mL、2.00×10-?mg/mL濃度記為p?(mg/mL)。待測時用相應緩沖液將待測試樣進行5倍或10倍梯度稀釋，稀釋后濃度記為47.2GUS蛋白誘導表達水平測定7.2.1試樣處理誘導GUS蛋白表達及樣品制備準備3個以上細胞培養(yǎng)板，每個板為一個重復，對每格進行編號，按檢測對象選擇相應的細胞系和標準物，將1mL的AuxREs::GUS細胞系加入細胞培養(yǎng)板的培養(yǎng)孔，每個孔再分別對應加入1mL細胞系培養(yǎng)液、不同濃度的NAA標準品工作液和不同濃度的試樣溶液，做好標記，25℃光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)6h進行處理誘導GUS表達。然后將處理后的細胞系轉移至10mL離心管，加入1mL抽提液混勻后冰上裂解20min。4℃14000g離心30min后吸取上清液即為樣品溶液。7.2.2樣品中總蛋白濃度的測定標準品牛血清蛋白溶液加入酶標板加樣孔中，加DPBS溶液補足至20.0μL(各孔中牛血清蛋白含量分別為0pg、0.40μg、μg);根據(jù)樣品中蛋白含量吸取適量樣品(體積為V?)加入酶標板加樣孔中，加DPBS溶液補足至20.0μL;每個標準品或樣品溶液重復加入3個加樣孔，以DPBS溶液為空白對照調(diào)零，然后分別加入200μL考馬斯亮藍染色液與標準品或樣品溶液混勻，在波長595nm處測量吸光度，以牛血清蛋白含量為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制標準曲線，并根據(jù)式(1)計算樣品中總蛋白濃度p總?！街校篜總——樣品的總蛋白濃度，單位為微克每微升(μg/μL);m——從標準曲線得到的樣品的蛋白質(zhì)含量，單位為微克(μg);V?——測蛋白含量時加樣的體積，單位為微升(μL)。計算結果保留至小數(shù)點后四位。7.2.3樣品中GUS蛋白酶活測定取適量樣品溶液(使總蛋白含量在20μg～200μg),記錄體積V?,加入1mL含有1mmol/L4-MUG的抽提液，37℃水浴，在水浴5min、25min、45min、65min以及85min時各取出200μL反應液，加入800μL反應終止液混勻后，吸取200μL加入酶標板加樣孔。吸取200μL4-MU使用液(4-MU含量分別為200nmol、100nmol、50nmol、25nmol、12.5nmol、6.25nmol),加入酶標板加樣孔。注意，每個樣品檢測酶標板上均需帶上標準品，每個標準品或樣品溶液重復加入3個加樣孔，以反應終止液為空白對照調(diào)零，在激發(fā)波長365nm,吸收波長455nm的條件下測量熒光強度。以4-MU標準品濃度為橫坐標，熒光強度為縱坐標繪制標準曲線，并通過該標準曲線將樣品反應后熒光強度換算為樣品反應后實際產(chǎn)生的4-MU的物質(zhì)的量，最后以樣品反應時間為橫坐標，樣品反應后產(chǎn)生的4-MU的物質(zhì)的量為縱坐標繪制標準曲線，計算GUS蛋白每分鐘水解4-MUG產(chǎn)生4-MU的物質(zhì)的量n,并根據(jù)式(2)計算樣品中GUS酶活y?！?2)式中：y———樣品中GUS酶活，單位為皮摩爾每分微克[pmol/(min·μg)];n——樣品中GUS蛋白每分鐘水解4-MUG產(chǎn)生4-MU的物質(zhì)的量，單位為皮摩爾每分(pmol/min);P總—-——樣品中總蛋白濃度，單位為微克每微升(μg/μL);V?—-—測GUS酶活時的加樣體積，單位為微升(μL)。5GB/T38484—2020計算結果保留至小數(shù)點后三位。7.3標準曲線繪制按7.2所述測定標準品工作液處理后GUS蛋白誘導表達水平，并參照附錄A對數(shù)據(jù)進行記錄。以10為底取標準品工作液濃度的對數(shù)值x為自變量，GUS酶活y為因變量，繪制標準曲線。按7.2所述測定試樣溶液處理后GUS蛋白誘導表達水平，并參照附錄A對數(shù)據(jù)進行記錄。y值在標準曲線線性范圍的試驗視為有效試驗，記錄試樣濃度pn,無效試驗所獲得的數(shù)據(jù)應舍去。然后依據(jù)有效y值從標準曲線中計算x,依據(jù)式(3)計算試樣中植物激素類次生代謝產(chǎn)物的生物活性，若有多個有效y值，則按式(3)計算取其平均值。式中：……………E——植物激素類次生代謝產(chǎn)物的生物活性；x——標準工作液濃度的對數(shù)值。以三次以上獨立實驗結果的平均值為試樣中含有的植物激素類次生代謝產(chǎn)物的生物活性定值，計算結果保留三位有效數(shù)字。8重復性在重復性條件下獲得的三次獨立測定結果的絕對值差值不得超過算數(shù)平均值的20%。A.1生長素活性檢測數(shù)據(jù)記錄見表A.1。檢測指標對照組試樣溶液細胞系培養(yǎng)液2.00×10-46.32×10-52.00×10-6.32×10-62.00×10-6試驗溶液實際濃度0蛋白濃度標準曲線1…n總蛋白濃度p1nn1n酶活y1n標準曲線xA.2細胞分裂素活性檢測數(shù)據(jù)記錄見表A.2。檢測指標對照組mg/mL試樣溶液mg/mL細胞系培養(yǎng)液2.00×10-36.32×10-42.00×10-46.32×10-52.00×10-5Pπ試驗溶液實際濃度01.00×10-33.16×10-41.00×10-43.16×10-51.00×10-5p?/2p,