GB∕T 39730-2020 細(xì)胞計(jì)數(shù)要求 流式細(xì)胞測(cè)定法

ICS07.080CCSC27中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞計(jì)數(shù)通用要求流式細(xì)胞測(cè)定法GF2020-12-14發(fā)布2021-07-01實(shí)施國家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)GB／T39730—2020前言 引言 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語、定義和縮略語 4方法原理 5通用要求 5.1試劑或材料 參考文獻(xiàn) ⅠGB／T39730—2020本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心提出并歸口。本文件起草單位：中國計(jì)量科學(xué)研究院。ⅡGB／T39730—2020流式細(xì)胞術(shù)是對(duì)液體中懸浮單顆?；蚣?xì)胞進(jìn)行高速、多參數(shù)分析的技術(shù)。通過流式細(xì)胞術(shù)可對(duì)生物制備樣本中的細(xì)胞進(jìn)行直接計(jì)數(shù)，既可以實(shí)現(xiàn)樣本中總細(xì)胞計(jì)數(shù)，還可以根據(jù)細(xì)胞特性進(jìn)行分型計(jì)數(shù)。為了實(shí)現(xiàn)不同實(shí)驗(yàn)室、平臺(tái)、操作人員等測(cè)量系統(tǒng)條件之間的數(shù)據(jù)一致性，需要對(duì)通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)試驗(yàn)的技術(shù)環(huán)節(jié)標(biāo)準(zhǔn)化。1GB／T39730—2020細(xì)胞計(jì)數(shù)通用要求流式細(xì)胞測(cè)定法本文件描述了流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞數(shù)量的術(shù)語、定義和縮略語、方法原理，以及包括試劑或材料、儀器設(shè)備、樣本制備、試驗(yàn)步驟、數(shù)據(jù)分析、方法確認(rèn)和報(bào)告的通用要求。本文件適用于研究、生產(chǎn)與檢驗(yàn)中使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行的細(xì)胞計(jì)數(shù)。2規(guī)范性引用文件本文件沒有規(guī)范性引用文件。3術(shù)語、定義和縮略語下列術(shù)語和定義適用于本文件。細(xì)胞計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量的測(cè)量。3.1.2細(xì)胞染色細(xì)胞特定成分與熒光染料或標(biāo)記了熒光染料的特異性抗體結(jié)合后進(jìn)行檢測(cè)的一種技術(shù)。注：特定成分為蛋白質(zhì)、DNA、RNA等。3.1.3有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)CRM附有由權(quán)威機(jī)構(gòu)發(fā)布的文件，提供使用有效程序獲得的具有不確定度和溯源性的一個(gè)或多個(gè)特性量值的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。來源3.1.4準(zhǔn)確度測(cè)量準(zhǔn)確度被測(cè)量的測(cè)得值與其真值之間的一致程度。來源有修改］3.1.5精密度測(cè)量精密度在規(guī)定條件下，對(duì)同一或類似被測(cè)對(duì)象測(cè)量所得示值或測(cè)得值間的一致程度。來源有修改］2GB／T39730—20203.1.6特異性測(cè)量系統(tǒng)的一種特性，通過特定的測(cè)量程序得到一個(gè)或多個(gè)被測(cè)對(duì)象的量值，每一被測(cè)對(duì)象的量值與被測(cè)系統(tǒng)中的其他被測(cè)對(duì)象或其他量值不相關(guān)。［來源：ISO20391-1:2018,3.24]下列縮略語適用于本文件。前向角散射光(側(cè)向角散射光(4方法原理計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球法：使用流式細(xì)胞儀，通過目標(biāo)細(xì)胞及計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球的光學(xué)（散射光和熒光）特性，對(duì)待測(cè)樣本中的目標(biāo)細(xì)胞和計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球進(jìn)行區(qū)分和計(jì)數(shù)。根據(jù)目標(biāo)細(xì)胞和計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球數(shù)量間的比例關(guān)系，計(jì)算得到待測(cè)樣本中目標(biāo)細(xì)胞的實(shí)際個(gè)數(shù)或濃度。體積法：流式細(xì)胞儀通過目標(biāo)細(xì)胞光學(xué)（散射光和熒光）特性和樣本體積測(cè)量，直接得到待測(cè)樣本中目標(biāo)細(xì)胞的實(shí)際個(gè)數(shù)或濃度。5通用要求選擇的熒光染料應(yīng)能被試驗(yàn)所用流式細(xì)胞儀的激光器激發(fā)，其激發(fā)光信號(hào)能被流式細(xì)胞儀的檢測(cè)器接收。5.1.2熒光染料標(biāo)記的抗體確保選擇的熒光染料標(biāo)記的抗體對(duì)目標(biāo)細(xì)胞具有特異性。鞘液應(yīng)為無熒光本底的平衡電解質(zhì)溶液，其潔凈度、吸光度、pH值、滲透壓應(yīng)滿足流式細(xì)胞儀的要求。緩沖溶液不應(yīng)造成待測(cè)細(xì)胞的破裂、形態(tài)嚴(yán)重改變或者聚團(tuán)，不應(yīng)對(duì)待測(cè)細(xì)胞的光學(xué)特性產(chǎn)生顯著影響，不應(yīng)含鈣離子和鎂離子的磷酸鹽緩沖液，根據(jù)具體細(xì)胞類型確定配制要求和方法。固定劑不應(yīng)造成待測(cè)細(xì)胞染色后的光學(xué)特性和形態(tài)嚴(yán)重改變。計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球應(yīng)大小均一，負(fù)載熒光物質(zhì)并且熒光強(qiáng)度一致，具有準(zhǔn)確的數(shù)量量值和不確定度，自3GB／T39730—2020發(fā)聚集度低。應(yīng)考慮為保證細(xì)胞計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確和可溯源，計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球的數(shù)量量值應(yīng)溯源至有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。熒光補(bǔ)償樣品為單熒光染色細(xì)胞或者熒光補(bǔ)償微球。熒光補(bǔ)償樣品的熒光染料應(yīng)與待測(cè)細(xì)胞所用的熒光染料一致。熒光補(bǔ)償樣品的熒光強(qiáng)度至少要與待測(cè)細(xì)胞一致，或者超過待測(cè)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。樣本保存管、微量移液器吸頭、進(jìn)樣管等其他材料，宜選擇低吸附性材料制成的。應(yīng)具有熒光檢測(cè)通道和散射光檢測(cè)通道，熒光通道能夠檢測(cè)選擇的熒光染料，散射光檢測(cè)通道包括流式細(xì)胞儀應(yīng)經(jīng)過校準(zhǔn)，并定期核查準(zhǔn)確度和精密度。微量移液器量程為微量移液器應(yīng)經(jīng)過檢定或校準(zhǔn)，并定期核查其移取量的準(zhǔn)確度和精密度。。使用者應(yīng)監(jiān)測(cè)并記錄渦旋振蕩器的使用轉(zhuǎn)速、時(shí)長等條件。用于細(xì)胞染色的孵育溫度控制或試劑、樣本的保存，例如冰箱。使用者應(yīng)監(jiān)測(cè)并記錄溫度控制裝置的溫度準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性。根據(jù)原始樣本的類型選擇合適的待測(cè)樣本制備方式。待測(cè)樣本應(yīng)是單分散細(xì)胞懸液，即待測(cè)樣本中的細(xì)胞以單個(gè)細(xì)胞存在，沒有細(xì)胞團(tuán)或細(xì)胞碎片。運(yùn)送條件應(yīng)不影響待測(cè)細(xì)胞的生物特性和檢測(cè)結(jié)果。待測(cè)樣本應(yīng)具有標(biāo)簽，標(biāo)簽上注明樣本類型、樣本采集和制備的時(shí)間和地點(diǎn)。細(xì)胞染色前，應(yīng)根據(jù)流式細(xì)胞儀的性能參數(shù)、待測(cè)細(xì)胞的黏附、自然沉降等特性來調(diào)整樣本中的細(xì)4GB／T39730—2020胞濃度。如果細(xì)胞濃度過高，可用緩沖溶液對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行稀釋，并記錄稀釋倍數(shù)。根據(jù)熒光染料或特異性的熒光染料標(biāo)記抗體質(zhì)量參數(shù)確定樣本量及染料、抗體濃度、孵育條件。保證待測(cè)樣本和熒光染料或特異性的熒光染料標(biāo)記抗體充分混合，應(yīng)選擇合適的渦旋轉(zhuǎn)速和時(shí)長，轉(zhuǎn)速過高或時(shí)間過長會(huì)造成細(xì)胞破損。待測(cè)樣本完成細(xì)胞染色后，盡快進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)。如果無法盡快上機(jī)檢測(cè)，可通過固定劑進(jìn)行固定并適當(dāng)條件保存，宜4℃~8℃避光保存。5.3.4.2計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球添加對(duì)滿足溯源至有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)條件的計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球進(jìn)行準(zhǔn)確添加，應(yīng)采用反向抽吸法，向裝有待測(cè)樣本的進(jìn)樣管中加入充分混勻的計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球溶液，或者在計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球干粉中加入待測(cè)樣本。添加計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球后應(yīng)避免樣本的離心洗滌導(dǎo)致的計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球丟失。樣本處理完成后應(yīng)盡快上機(jī)試驗(yàn)，上機(jī)前進(jìn)行充分混勻，避免放置導(dǎo)致的細(xì)胞和計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球沉降。應(yīng)選擇合適的渦旋轉(zhuǎn)速和時(shí)間，轉(zhuǎn)速過高或時(shí)間過長會(huì)造成細(xì)胞破碎或計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球吸附管壁?？蓪?duì)被測(cè)樣本和計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球的移取量進(jìn)行精確稱量，提高測(cè)量準(zhǔn)確度和精密度。5.4試驗(yàn)步驟根據(jù)流式細(xì)胞儀的儀器說明書設(shè)置儀器的工作條件，包括環(huán)境溫度、濕度、電源電壓、大氣壓力、環(huán)境光照等。每次開機(jī)后，對(duì)流式細(xì)胞儀的光路系統(tǒng)進(jìn)行校驗(yàn)，可參考流式細(xì)胞儀的校驗(yàn)參數(shù)檢測(cè)FSC、SSC和各熒光通道的平均熒光強(qiáng)度、變異系數(shù)和熒光分辨率。5.4.3細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)量應(yīng)設(shè)置陰性對(duì)照、陽性對(duì)照、同型對(duì)照、熒光扣除對(duì)照，用于識(shí)別目標(biāo)細(xì)胞并確認(rèn)目標(biāo)細(xì)胞的染色方案是否正確。使用不含任何熒光染料及計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球的待測(cè)細(xì)胞樣本作為陰性對(duì)照。使用已經(jīng)證明可有效地與待測(cè)熒光染料結(jié)合的細(xì)胞樣本作為陽性對(duì)照。使用與熒光染料標(biāo)記的抗體相同種屬來源、同種免疫球蛋白的相同亞型的相同劑量抗體染色的細(xì)胞樣品作為同型對(duì)照。使用兩個(gè)和兩個(gè)以上的熒光染料或熒光染料標(biāo)記抗體組合標(biāo)記細(xì)胞樣本時(shí)，在完整的染色基礎(chǔ)上使用減少一種熒光染料或熒光染料標(biāo)記抗體進(jìn)行細(xì)胞染色的待測(cè)細(xì)胞樣本作為熒光扣除對(duì)照。進(jìn)樣間隔期間，應(yīng)使用清洗液對(duì)儀器管道進(jìn)行清洗。選擇合適的檢測(cè)通道后，根據(jù)使用的熒光染料或相關(guān)試劑盒提供的質(zhì)量參數(shù)設(shè)置系列雙參數(shù)散點(diǎn)圖或單參數(shù)直方圖和閾值。5GB／T39730—2020根據(jù)陰性對(duì)照、陽性對(duì)照的FSC、SSC和熒光信號(hào)的強(qiáng)弱調(diào)整電壓大小。通過調(diào)整電壓使陰性對(duì)照、陽性對(duì)照的細(xì)胞FSC、SSC信號(hào)與細(xì)胞碎片或雜質(zhì)分開處于對(duì)應(yīng)散點(diǎn)圖中部，見圖1。圖1流式分析圖譜中細(xì)胞信號(hào)示意圖通過調(diào)整電壓使陽性對(duì)照的熒光信號(hào)處于雙參數(shù)散點(diǎn)圖［見圖2a)]中對(duì)應(yīng)熒光通道強(qiáng)度軸閾值的上方，或單參數(shù)直方圖［見圖2b)]中對(duì)應(yīng)熒光強(qiáng)度軸閾值的右方；陰性對(duì)照的熒光信號(hào)處于雙參數(shù)散點(diǎn)圖中對(duì)應(yīng)熒光通道強(qiáng)度軸閾值的下方，或單參數(shù)直方圖中對(duì)應(yīng)熒光強(qiáng)度軸閾值的左方，見圖2。標(biāo)引序號(hào)說明：陰性對(duì)照；陽性對(duì)照。圖2流式分析圖譜中陰性／陽性對(duì)照的熒光通道信號(hào)類群區(qū)分示意圖采用兩種及以上染料組合方案進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)或光學(xué)檢測(cè)通道的電壓及增益發(fā)生變動(dòng)時(shí)，需要進(jìn)行熒光補(bǔ)償。熒光補(bǔ)償樣品進(jìn)樣完成后，根據(jù)儀器操作軟件的指示進(jìn)行手工方式補(bǔ)償或自動(dòng)補(bǔ)償。使用同型對(duì)照和熒光扣除對(duì)照進(jìn)行對(duì)比，通過相應(yīng)散點(diǎn)圖中的熒光強(qiáng)度表達(dá)，從陽性對(duì)照的熒光信6GB／T39730—2020號(hào)中區(qū)分出目標(biāo)細(xì)胞的陽性信號(hào)并進(jìn)行設(shè)門。應(yīng)在進(jìn)樣穩(wěn)定后開始采集信號(hào)。總細(xì)胞信號(hào)采集數(shù)量不應(yīng)小于10000個(gè)，計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球信號(hào)采集數(shù)量不應(yīng)小于1000個(gè)。若總細(xì)胞信號(hào)采集數(shù)量為10000個(gè)時(shí)，不能獲取1000個(gè)計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球采集數(shù)量，則應(yīng)加大總細(xì)胞信號(hào)采集數(shù)量。信號(hào)采集時(shí)間應(yīng)保持在合理范圍內(nèi)，過長時(shí)間可能導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生聚集或細(xì)胞、計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球的沉降。5.5數(shù)據(jù)分析按照公式(1)計(jì)算目標(biāo)細(xì)胞的濃度值：式中：Ncell—獲取目標(biāo)細(xì)胞數(shù)量，單位為個(gè)；Nball—獲取計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球數(shù)量，單位為個(gè)；—樣本中添加的計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球數(shù)量，單位為個(gè)；V—待測(cè)樣本加樣體積（不含熒光染料或特異性的熒光染料標(biāo)記單克隆抗體溶液，計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球懸浮液等添加物體積單位為微升(μL);D—樣本稀釋倍數(shù)。計(jì)數(shù)直接來源于流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)，由專用軟件直接計(jì)算生成。應(yīng)對(duì)具體測(cè)量方法進(jìn)行方法性能確認(rèn)。方法性能參數(shù)包括準(zhǔn)確度、精密度、工作范圍（檢出限、線性范圍等）、特異性、方法穩(wěn)健性和組間精密度（應(yīng)建立評(píng)估方法性能參數(shù)的方案和標(biāo)準(zhǔn)，制定并保存相應(yīng)的文件。報(bào)告提供的信息應(yīng)至少包括：a)使用儀器信息，包括儀器的參數(shù)設(shè)定