3.2基因工程的基本操作程序（第二課時(shí)）課件高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修3

第三章基因工程第2節(jié)基因工程的基本操作程序（第二課時(shí)）目錄/CONTENTS01目的基因的篩選與獲取02基因表達(dá)載體的構(gòu)建03將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞04目的基因的檢測(cè)與鑒定學(xué)習(xí)目標(biāo)：1.闡明基因工程的原理和基本操作程序。2.針對(duì)人類生產(chǎn)或生活中的某一需求，選取適當(dāng)?shù)幕蚬こ痰募夹g(shù)和方法，嘗試設(shè)計(jì)獲得某一轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的方案。3.嘗試進(jìn)行PCR的基本操作并用電泳鑒定PCR的產(chǎn)物。耐高溫的DNA聚合酶(Taq酶）4種脫氧核苷酸（DNTP）引物待擴(kuò)增的DNA片段（模板）5’5’變性復(fù)性延伸溫度上升到90℃以上，雙鏈DNA解聚為單鏈當(dāng)溫度下降到50℃左右時(shí)，兩種引物通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合。溫度上升到72℃左右時(shí)，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA鏈。舊識(shí)回顧二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建1.基因表達(dá)載體的構(gòu)建的目的？載體還需要哪些結(jié)構(gòu)？各個(gè)元件有什么作用？2.目的基因插入什么位置？目的基因插入位點(diǎn)是隨意的嗎？3.請(qǐng)文字和箭頭表示基因表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程。4.使用一種DNA限制酶進(jìn)行切割，是否只會(huì)得到一種重組DNA？如果不能，怎么改進(jìn)？合作探究：請(qǐng)同學(xué)們自主閱讀教材，小組合作思考討論完成問(wèn)題。

目錄02二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建問(wèn)題:獲取了足夠量的目的基因后，能直接把目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞嗎？就算可以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯成蛋白質(zhì)，游離的DNA片段也無(wú)法隨著細(xì)胞分裂進(jìn)行復(fù)制，導(dǎo)致子代細(xì)胞不再含有目的基因游離的DNA片段進(jìn)入受體細(xì)胞，一般會(huì)直接被分解

那怎樣才能讓基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且遺傳給下一代呢？二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建1.構(gòu)建基因表達(dá)載體的目的①讓基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且遺傳給下一代;

②使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用思考：要各個(gè)元件有什么作用？2.基因表達(dá)載體的組成構(gòu)建基因表達(dá)載體是基因工程的核心。二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建目的基因：能控制表達(dá)所需要的特殊性狀(必須插到啟動(dòng)子和終止子之間)復(fù)制原點(diǎn)：DNA復(fù)制的起始位點(diǎn)終止子：本質(zhì)：有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段位置：基因的下游功能：終止轉(zhuǎn)錄四環(huán)素抗性基因、熒光蛋白基因等啟動(dòng)子：本質(zhì)：有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段位置：基因的上游功能：RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA標(biāo)記基因：作用為鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來(lái)二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建提問(wèn)：目的基因該插入什么位置？目的基因插入位點(diǎn)不是隨意的：基因表達(dá)載體需要啟動(dòng)子與終止子的調(diào)控，所以目的基因應(yīng)插入

，若目的基因插入啟動(dòng)子部位，啟動(dòng)子將失去原功能。啟動(dòng)子和終止子之間的部位當(dāng)誘導(dǎo)物存在時(shí)，可以激活或抑制目的基因的表達(dá)。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子：誘導(dǎo)型啟動(dòng)子誘導(dǎo)物作用激活或抑制目的基因表達(dá)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子：二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建提問(wèn)：辨析：“啟動(dòng)子與終止子”和“起始密碼子與終止密碼子”。項(xiàng)目啟動(dòng)子終止子起始密碼子終止密碼子本質(zhì)位置目的基因上游目的基因下游mRNA首端mRNA尾端功能DNADNAmRNAmRNARNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來(lái)翻譯的起始信號(hào)(編碼氨基酸)翻譯的結(jié)束信號(hào)(不編碼氨基酸)提問(wèn)：請(qǐng)文字和箭頭表示基因表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程。二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建3.基因表達(dá)載體構(gòu)建的過(guò)程：質(zhì)粒載體限制酶目的基因限制酶切割位點(diǎn)限制酶切割位點(diǎn)限制酶在構(gòu)建抗蟲棉的基因表達(dá)載體時(shí)，首先會(huì)用一定的限制酶切割載體，使它出現(xiàn)一個(gè)切口用同種限制酶或能產(chǎn)生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段DNA連接酶重組DNA分子基因表達(dá)載體（核心工作）二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建問(wèn)題探討：1、使用一種限制酶進(jìn)行切割（單酶切），是否只會(huì)得到目的基因與載體結(jié)合的這一種重組DNA？單酶切：選擇一種限制酶同時(shí)對(duì)目的基因和質(zhì)粒切割。同尾酶：切割不同的DNA片段但產(chǎn)生相同末端的一類限制酶。

單酶切的缺點(diǎn)（效率不高）:①質(zhì)粒、目的基因自身環(huán)化；②質(zhì)粒與目的基因反向連接正向連接反向連接122’1’22’1’1二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建問(wèn)題探討：2、如何防止目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化以及目的基因的反向連接？雙酶切的優(yōu)點(diǎn):①

防止質(zhì)粒重新環(huán)化②防止目的基因自身環(huán)化③

防止質(zhì)粒與目的基因反向連接雙酶切：選擇兩種不同的限制酶同時(shí)對(duì)目的基因和質(zhì)粒切割二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建限制酶的選擇原則(3)確保出現(xiàn)相同黏性末端原則：通常選擇與切割目的基因相同的限制酶切割質(zhì)粒，如圖中

；為避免目的基因和質(zhì)粒自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，如圖也可選擇

和

兩種限制酶。(1)不破壞目的基因原則：如圖甲中可選擇

，而不選擇

。(2)保留標(biāo)記基因、啟動(dòng)子、終止子、復(fù)制原點(diǎn)原則：所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)，如圖乙中不選擇

。PstⅠSmaⅠSmaⅠPstⅠPstⅠEcoRⅠ二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建基因工程操作程序的核心步驟是目的基因的獲取 (

)基因表達(dá)載體中有的含有啟動(dòng)子和終止密碼子(

)標(biāo)記基因不一定是抗生素抗性基因(

)當(dāng)誘導(dǎo)物存在時(shí)，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可以激活或抑制目的基因的表達(dá)(

)

××√√1.目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞之前,需構(gòu)建基因表達(dá)載體,圖甲、乙表示質(zhì)粒及目的基因所在DNA片段,圖中箭頭表示相關(guān)限制酶的酶切位點(diǎn)。(1)構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)需要使用的工具酶為

。

(2)用圖中的質(zhì)粒和DNA構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí),不能使用SmaⅠ切割,原因是

。

(3)構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí),可用EcoRⅠ同時(shí)切割質(zhì)粒和DNA,但會(huì)導(dǎo)致

等問(wèn)題,為避免以上問(wèn)題出現(xiàn),應(yīng)使用

兩種限制酶。

SmaⅠ會(huì)破壞質(zhì)粒的抗生素抗性基因和外源DNA中的目的基因目的基因自身環(huán)化、目的基因不能定向連接BamHⅠ和HindⅢ(或EcoRⅠ和HindⅢ)限制酶和DNA連接酶(4)構(gòu)建好的基因表達(dá)載體在目的基因前要加上

,其是

識(shí)別和結(jié)合的部位。

RNA聚合酶啟動(dòng)子二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建2.某目基因兩側(cè)的DNA序列所含的限制酶酶切位點(diǎn)如圖所示,下列可作該目的基因最佳載體的是 (

)

A

BC

DA二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建3.下列關(guān)于基因表達(dá)載體的敘述不正確的是(

)A.啟動(dòng)子是與RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，是起始密碼B.啟動(dòng)子和終止子都是特殊結(jié)構(gòu)的DNA短片段，對(duì)mRNA的轉(zhuǎn)錄起調(diào)控作用C.標(biāo)記基因是為了鑒別受體細(xì)胞中是否有目的基因從而便于篩選D.基因表達(dá)載體的構(gòu)建視受體細(xì)胞及導(dǎo)入方式不同而有所差別A二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建4.下列關(guān)于基因表達(dá)載體構(gòu)建的敘述，錯(cuò)誤的是（）A.啟動(dòng)子是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的位點(diǎn)，組成它的基本單位是脫氧核苷酸B.基因表達(dá)載體的組成包括目的基因、啟動(dòng)子、終止密碼子、標(biāo)記基因等組件C.人工構(gòu)建的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，當(dāng)誘導(dǎo)物存在時(shí)，可激活或抑制目的基因的表達(dá)D.由于受體細(xì)胞不同，基因表達(dá)載體的構(gòu)建也有所差別B二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建5.圖A、圖B分別表示質(zhì)粒和外源DNA，其中箭頭表示相關(guān)限制酶的酶切位點(diǎn)，下列敘述正確的是(

)A.用質(zhì)粒和外源DNA構(gòu)建重組質(zhì)粒過(guò)程中，不能使用SmaⅠ切割B.圖A所示的質(zhì)粒分子在經(jīng)SmaⅠ酶切割后含有4個(gè)游離的磷酸基團(tuán)C.為獲取重組質(zhì)粒，將切割后的質(zhì)粒與目的基因片段混合，并加入DNA聚合酶D.用EcoRⅠ、HindⅢ和BamHⅠ中的任意一種酶切割質(zhì)粒和外源基因都可以A二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建6.在基因表達(dá)載體的構(gòu)建中,下列說(shuō)法正確的是 (

)①一個(gè)基因表達(dá)載體的組成只包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子②有了啟動(dòng)子才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA③終止子的作用是使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停止④所有基因表達(dá)載體的構(gòu)建是完全相同的⑤必須在細(xì)胞外進(jìn)行A.②③⑤ B.①④ C.①②⑤ D.③④A目錄03三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞合作探究：請(qǐng)同學(xué)們自主閱讀教材P81，小組合作思考討論完成問(wèn)題。

1.總結(jié)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法有哪些？各自適用于什么生物？2.農(nóng)桿菌的特點(diǎn)？農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的原理。3.請(qǐng)文字和箭頭表示農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的過(guò)程。三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1.轉(zhuǎn)化將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過(guò)程。實(shí)質(zhì)是基因重組?；虮磉_(dá)載體受體細(xì)胞導(dǎo)入動(dòng)物植物微生物三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞2.轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞受體細(xì)胞將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法花粉管通道法——顯微注射法——Ca2+處理法（我國(guó)科學(xué)家獨(dú)創(chuàng)）（常用）三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（1）花粉管通道法（我國(guó)科學(xué)家獨(dú)創(chuàng)的將Bt基因?qū)朊藁?xì)胞的方法）1.目的基因?qū)胫参锛?xì)胞含目的基因的DNA溶液方法一：用微量注射器將含目的基因的DNA溶液（含構(gòu)建好的基因表達(dá)載體的溶液）直接注入子房中三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（1）花粉管通道法（我國(guó)科學(xué)家獨(dú)創(chuàng)）1.目的基因?qū)胫参锛?xì)胞方法二：在植物受粉后的一定時(shí)間內(nèi)，花粉管還沒(méi)有愈合前，剪去柱頭，將DNA（含目的基因）溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入胚囊。適用生物：開花植物三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（2）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（常用）1.目的基因?qū)胫参锛?xì)胞①農(nóng)桿菌特點(diǎn)：是一種微生物，自然條件下易感染雙子葉植物和裸子植物，對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒(méi)有感染能力。三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（2）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（常用）1.目的基因?qū)胫参锛?xì)胞轉(zhuǎn)化：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過(guò)程。實(shí)質(zhì)是基因重組。②原理：農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)含有

，當(dāng)它侵染植物細(xì)胞時(shí)，Ti質(zhì)粒的

可轉(zhuǎn)移至被侵染的植物細(xì)胞，并整合到該植物細(xì)胞的

。T-DNA染色體DNA上Ti質(zhì)粒思考：構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，目的基因該插到Ti質(zhì)粒哪里？T—DNA上（可轉(zhuǎn)移的DNA）三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（2）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（常用）③過(guò)程：T-DNA目的基因構(gòu)建表達(dá)載體含目的基因的重組Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌含重組Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌導(dǎo)入植物細(xì)胞表現(xiàn)出新性狀的植物植物細(xì)胞將目的基因插入染色體DNA中植物組織培養(yǎng)三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（2）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（常用）1.目的基因?qū)胫参锛?xì)胞目的基因Ti質(zhì)粒表達(dá)載體農(nóng)桿菌植物細(xì)胞植物細(xì)胞染色體DNA新性狀植株構(gòu)建轉(zhuǎn)入導(dǎo)入插入表達(dá)三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（2）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（常用）1.目的基因?qū)胫参锛?xì)胞1.兩次拼接第一次拼接：第二次拼接(非人工操作)：2.兩次導(dǎo)入第一次導(dǎo)入：第二次導(dǎo)入(非人工操作)：導(dǎo)入的植物的受體細(xì)胞可以是什么細(xì)胞呢？目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的T-DNA上；被插入目的基因的T-DNA拼接到受體細(xì)胞染色體的DNA上。將含目的基因的重組Ti質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌；含目的基因的T-DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。

第1次拼接第2次拼接第1次導(dǎo)入第2次導(dǎo)入三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（2）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（常用）1.目的基因?qū)胫参锛?xì)胞④具體轉(zhuǎn)化方法：a.可以將從新鮮的葉片上取下的圓形小片與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，然后篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞，并再生成植株。b.可以將花序直接浸沒(méi)在含有農(nóng)桿菌的溶液中一段時(shí)間，然后培養(yǎng)植株并獲得種子，再進(jìn)行篩選、鑒定等。導(dǎo)入的植物的受體細(xì)胞可以是什么細(xì)胞呢？三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞2.目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞（1）常用方法：（2）受體細(xì)胞:顯微注射法受精卵思考：為什么常選用受精卵作為受體細(xì)胞呢？①

體積大，易操作。②

全能性高，易培養(yǎng)成完整個(gè)體。（3）過(guò)程:構(gòu)建基因表達(dá)載體并提純利用顯微注射將基因表達(dá)載體注入動(dòng)物的受精卵中早期胚胎培養(yǎng)胚胎移植獲得具有新性狀的動(dòng)物三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞2.目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞了解：病毒介導(dǎo)法:科學(xué)家用病毒DNA與目的基因一起構(gòu)建的載體，去感染受體動(dòng)物細(xì)胞，也能使目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞內(nèi)。如用腺病毒載體，搭載新冠病毒S基因，進(jìn)入人體內(nèi)，使人體產(chǎn)生對(duì)S蛋白的免疫記憶。三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞3.目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞（1）常用方法：Ca2+處理法Ca2+的作用：增加細(xì)胞壁的通透性，使細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)（感受態(tài)細(xì)胞）。Ca2+（CaCl2溶液）感受態(tài)細(xì)胞吸收（2）受體細(xì)胞:微生物（常用大腸桿菌）優(yōu)點(diǎn)：①繁殖快②多為單細(xì)胞③遺傳物質(zhì)相對(duì)較少三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞實(shí)例：利用轉(zhuǎn)基因大腸桿菌生產(chǎn)藥物Ca2+處理大腸桿菌細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞(細(xì)胞膜通透性增強(qiáng))基因表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子（3）過(guò)程:注：原核生物作為受體細(xì)胞產(chǎn)生的真核生物的蛋白質(zhì)通常