TGXAS-家蠶抗血液型膿病性能跟蹤測試技術(shù)規(guī)程編制說明

團體標準《家蠶抗血液型膿病性能跟蹤測試技術(shù)規(guī)程》（征求意見稿）編制說明項目來源根據(jù)《廣西標準化協(xié)會關(guān)于下達2023年第十批團體標準制修定項目計劃的通知》（桂標協(xié)〔2023〕50號）精神，由廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)技術(shù)推廣站提出，廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)技術(shù)推廣站、河池市蠶業(yè)技術(shù)推廣站，廣西農(nóng)業(yè)工程職業(yè)技術(shù)學院共同起草的團體標準《家蠶抗血液型膿病性能跟蹤測試技術(shù)規(guī)程》獲批立項（項目編號：2023-1005）。項目背景及目的意義我國是世界蠶業(yè)起源中心，廣西是全國蠶桑第一大省。國家實施“東桑西移”產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)換以來，廣西蠶業(yè)迅猛發(fā)展，取得了令人矚目的成就，為廣西農(nóng)業(yè)增效、農(nóng)民增收、縣域經(jīng)濟發(fā)展和社會主義新農(nóng)村建設(shè)做出了重要貢獻，已成為廣西的新興優(yōu)勢特色產(chǎn)業(yè)，更是部分地區(qū)的主要支柱產(chǎn)業(yè)，在脫貧攻堅和鄉(xiāng)村振興起了重要的作用。2022年，廣西桑園面積284.18萬畝，蠶繭產(chǎn)量43.71萬噸，約占全國總產(chǎn)量的59.16%，連續(xù)18年位居全國第一；養(yǎng)蠶售繭收入206.79億元，連續(xù)兩年超200億元；一二三產(chǎn)業(yè)融合發(fā)展，全產(chǎn)業(yè)總產(chǎn)值近600億元。但是養(yǎng)蠶業(yè)一直面臨嚴重的病害威脅，每年因蠶病暴發(fā)造成的減產(chǎn)約占蠶業(yè)生產(chǎn)總產(chǎn)量的20%左右，其中家蠶血液型膿病是養(yǎng)蠶病害病害之首，由家蠶核型多角體病毒（BmNPV）感染家蠶引起的，是一種亞急性家蠶病毒病，該病發(fā)病快，傳染性強，難控制，給蠶業(yè)生產(chǎn)造成巨大經(jīng)濟損失。廣西蠶區(qū)位于南亞熱帶，氣候悶熱多濕，是此病的高發(fā)地區(qū)，給廣西蠶業(yè)生產(chǎn)造成很大的危害。過去，家蠶血液型膿病的防控依賴于嚴格的養(yǎng)蠶全過程消毒和飼養(yǎng)技術(shù)，近年，國內(nèi)對抗血液型膿病品種的創(chuàng)新選育與應用，從品種角度有效抵抗血液型膿病的發(fā)生，是抵御家蠶血液型膿病最經(jīng)濟有效的方法，是蠶桑產(chǎn)業(yè)的重大突破。受抗血液型膿病遺傳特性影響，在無抗性跟蹤監(jiān)測并加以選擇，隨著繁育世代上的增加，抗病將難以得到有效維持，因此抗性跟蹤測試在抗病品種選育創(chuàng)新和產(chǎn)業(yè)化應用的重要意義。長期以為，廣西蠶種質(zhì)資源保種場在抗血液型膿病蠶品種收集、創(chuàng)新、保存上做了大量的工作，近十年，育成了抗血液型膿病蠶品種“桂蠶N2”“桂蠶8號”“桂蠶9號”“桂蠶10號”“桂蠶11號”等多對抗血液型膿病家蠶新品種并推廣應用。本標準的建立具有重要的現(xiàn)實意義。鑒于有關(guān)家蠶抗血液型膿病性能跟蹤測試目前尚沒有相關(guān)的國家標準、行業(yè)標準和地方標準，通過本標準的制定規(guī)范抗性跟蹤測試操作，加快抗血液型膿病育種進程，降低消毒防病藥品和勞動力投入，促進養(yǎng)蠶適度規(guī)模化進程，助力蠶業(yè)綠色生產(chǎn)、農(nóng)業(yè)節(jié)本增效，為廣西乃至我國蠶桑產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展做出貢獻。項目編制過程（一）成立標準編制工作組團體標準《家蠶抗血液型膿病性能跟蹤測試技術(shù)規(guī)程》項目任務(wù)下達后，廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)技術(shù)推廣站成立了標準編制工作組，起草單位制定了起草編寫方案與進度安排，明確任務(wù)職責，確定工作技術(shù)路線，開展標準研制工作。編制工作組下設(shè)三個組，分別是資料收集組、草案編寫組、標準實施組。資料收集組負責國內(nèi)外有關(guān)家蠶抗血液型膿病性能跟蹤測試技術(shù)的文獻資料的查詢、收集和整理工作，查閱家蠶抗血液型膿病性能跟蹤測試的研究情況和目前對家蠶抗血液型膿病性能跟蹤測試的研究進展。草案編寫組負責起草標準草案、征求意見稿和標準編制說明、送審稿及編制說明的編寫工作，包括后期召開征求意見會、網(wǎng)上征求意見，以及標準的修改和完善。標準實施組負責《家蠶抗血液型膿病性能跟蹤測試技術(shù)規(guī)程》團體標準發(fā)布后，督促各相關(guān)從業(yè)人員廣泛認知，在工作中嚴格貫徹標準，并對標準實施情況進行總結(jié)分析，對標準提出修正意見。（二）收集整理文獻資料標準編制工作組收集了國內(nèi)有關(guān)家蠶抗血液型膿病性能跟蹤測試技術(shù)相關(guān)文獻資料。主要有：NY∕T3152.3-2017微生物農(nóng)藥環(huán)境風險評價試驗準則第3部分：家蠶毒性試驗DB11/T1432—2017生物防治產(chǎn)品應用技術(shù)規(guī)程舞毒蛾核型多角體病毒（北京市地方標準）DB44/T2240-2020油桐尺蠖核型多角體病毒殺蟲劑使用技術(shù)規(guī)程DB42/T675-2010茶尺蠖核型多角體病毒制劑生產(chǎn)及應用技術(shù)規(guī)程DB33/T2183-2019家蠶核型多角體病抗性鑒定方法，浙江地方標準DB51/T1207-2011桑蠶血液型膿病診斷技術(shù)規(guī)程，四川地方標準（三）研討確定標準主體內(nèi)容標準編制工作組在對收集的資料進行整理研究之后，標準編制工作組召開了標準編制會議，對標準的整體框架結(jié)構(gòu)進行了研究，并對標準的關(guān)鍵性內(nèi)容進行了初步探討。經(jīng)過研究，標準的主體內(nèi)容確定為家蠶抗血液型膿病性能跟蹤測試的術(shù)語定義、設(shè)施設(shè)備，測試蠶品種飼養(yǎng)，取樣，攻毒，攻毒后管理、發(fā)病調(diào)查、發(fā)病率計算等操作指示。（四）調(diào)研及形成草案、征求意見稿工作小組對家蠶抗血液型膿病性能跟蹤測試的實驗研究成果進行系統(tǒng)總結(jié)。形成了標準的基本構(gòu)架，對主要內(nèi)容進行了討論并對項目的工作進行了部署和安排。2023年3-4月，在前期工作的基礎(chǔ)之上，整合已有的數(shù)據(jù)資料中有關(guān)家蠶抗血液型膿病性能跟蹤技術(shù)要求，并結(jié)合廣西多年家蠶抗血液型膿病選育工作實際要求的基礎(chǔ)上，按照簡化、統(tǒng)一等原則編制完成團體標準《家蠶抗血液型膿病性能跟蹤測試技術(shù)規(guī)程》（草案）。2023年5月，標準起草工作組通過實地調(diào)研，掌握相關(guān)人員關(guān)于家蠶抗血液型膿病性能跟蹤測試技術(shù)的具體技術(shù)要求。將草案分發(fā)至相關(guān)單位內(nèi)部征求意見，針對收集到的意見，標準編制工作組多次召開會議，以草案為基礎(chǔ)，提煉核心技術(shù)細節(jié)，對標準草案進行了反復修改和研究討論，進一步討論完善標準草案，形成團體標準《家蠶抗血液型膿病性能跟蹤測試技術(shù)規(guī)程》（征求意見稿）和（征求意見稿）編制說明。標準制定原則（一）實用性原則目前尚無家蠶抗血液型膿病性能跟蹤測試方面的標準，因此本標準的撰寫主要基于起草單位多年的實際工作經(jīng)驗的總結(jié)及大量查詢文獻的基礎(chǔ)上形成，充分考慮了我區(qū)家蠶抗血液型膿病性能跟蹤測試的操作實際情況。具有較強的實用性和可操作性。（二）協(xié)調(diào)性原則本文件編寫過程中注意了與家蠶抗血液型膿病性能跟蹤測試相關(guān)法律法規(guī)的協(xié)調(diào)問題，在內(nèi)容上與現(xiàn)行法律法規(guī)、標準協(xié)調(diào)一致。（三）規(guī)范性原則本文件嚴格按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的要求和規(guī)定編寫本標準的內(nèi)容，保證標準的編寫質(zhì)量。標準主要條款的說明本標準確立了家蠶抗血液型膿病性能跟蹤測試的程序，界定了家蠶抗血液型膿病性能跟蹤測試技術(shù)規(guī)程涉及的術(shù)語和定義，規(guī)定了設(shè)施設(shè)備，以及測試品種的飼育、取樣、病毒懸浮液的制備、攻毒操作方法、發(fā)病調(diào)查、發(fā)病率計算及數(shù)據(jù)記錄等操作指示。（一）術(shù)語和定義明確了“家蠶核型多角體病毒多角體”“攻毒”的術(shù)語和定義，依據(jù)DB33/T2183-2019《家蠶核型多角體病抗性鑒定方法》結(jié)合跟蹤測試試驗操作實際確定。（二）設(shè)施設(shè)備跟蹤測試蠶房為專用，獨立于生產(chǎn)養(yǎng)蠶區(qū)域；測試房間配置養(yǎng)蠶設(shè)備、控溫控濕設(shè)備及消毒機具。與病毒制備房間相鄰，配備光學顯微鏡、低速離心機、純水機、冰箱、血球計數(shù)器、移液槍；主要依據(jù)起草單位多年實際操作需要確定。（三）跟蹤測試技術(shù)流程技術(shù)流程主要依據(jù)起草單位多年的跟蹤測試實際流程確定，流程圖見圖1：取樣取樣發(fā)病調(diào)查記錄結(jié)果攻毒攻毒管理消毒清洗選留蠶區(qū)上蔟采繭調(diào)查制種蠶種保護催青收蟻圖1家蠶抗血液型膿病性能跟蹤測試技術(shù)流程圖（四）技術(shù)要求家蠶飼養(yǎng)飼育方法及技術(shù)要求家蠶品種繼代時，選育人員根據(jù)選育計劃確定需要跟蹤測試的品種及區(qū)數(shù)，同時確定對照品種。常規(guī)飼養(yǎng)至2齡起蠶，按照DB45/T83的規(guī)定執(zhí)行，包括蠶室溫濕度環(huán)境、桑葉質(zhì)量、飼養(yǎng)管理和眠起處理。核型多角體病毒桑葉準備將病毒配制成目的濃度懸液。將新鮮桑葉浸入病毒懸液中，充分浸漬均勻，取出，待桑葉表面水分晾干后備用。2齡起蠶添食病毒，常用浸葉法和涂抹法。實驗室常用涂抹法，固定劑量的病毒懸液涂抹在固定面積的桑葉上，晾干再喂食。此方法比起浸葉法精度較高，但是極耗工耗時。但是我們做跟蹤測試的規(guī)模一般都比較大，不可行，所以采用浸葉法。據(jù)《應用抗病育種技術(shù)育成廣西首對抗血液型膿病桑蠶新品種“桂蠶N2”》報道，采用定量涂抹法，濃度為1×107PIBs/ml病毒添食兩廣二號2齡起蠶，正交76.52%，反交69.22%，平均發(fā)病率為72.87%。我們采用浸葉法添食在濃度1×107添食兩廣二號，正交發(fā)病率為 73.94% ，反交發(fā)病率 71.14%，平均發(fā)病率為72.53%，與采用涂抹法添食的發(fā)病率基本一致（表一），可見浸葉法也能達到測試篩選效果。表一兩廣二號2齡起蠶浸葉法測試發(fā)病率添食濃度正交反交膿病頭數(shù)其他死蠶存活頭數(shù)膿病發(fā)生率（%）膿病頭數(shù)其他死蠶存活頭數(shù)膿病發(fā)生率（%）1×1064509532.1434211422.971×10710583773.9410614371.141×1081452497.3213501689.401×10915000100.0015000100取樣及要求受試蠶品種及對照品種均在2齡起蠶餉食前取樣。每區(qū)取樣30頭，3個重復。取樣的蠶放至樣品飼喂盒，并隨樣本傳遞一份含有樣本信息（包括蠶品種名或代號、區(qū)號、抽樣數(shù)量等信息）的小區(qū)片。家蠶對BmNPV的抗性隨蠶齡的增加而增強，蠶齡越小越容易染??；而在同一齡期一般起蠶最低。而1齡蠶太小，調(diào)查發(fā)病率時較費力。所以選在2齡起蠶添食病毒進行測試。攻毒將備好的病毒葉切成3cm×3cm大小給蠶喂食，每區(qū)喂3片。攻毒后飼養(yǎng)飼養(yǎng)溫度27℃-28℃，濕度85%-90%。第2餐開始換為無病毒普通桑葉飼喂。飼喂前去除病毒葉殘葉、蠶沙，更換蠶座及墊紙，蠶體、蠶座撒新鮮石灰粉進行消毒。溫濕度是依據(jù)DB45/T83種繭育養(yǎng)蠶技術(shù)規(guī)程給出。發(fā)病調(diào)查添食后64h-92h開始至3齡起蠶為調(diào)查時間。家蠶血液型膿病屬于亞急性傳染病，感染后一般小蠶3-4天即開始發(fā)?。ㄒ痢缎Q病學》）。品種間發(fā)病有快慢，發(fā)育快的在添食后64h開始出現(xiàn)病癥，慢的品種則能到92h才顯現(xiàn)病癥。病癥及確定方法以家蠶血液型膿病的典型癥狀結(jié)合光學顯微鏡鏡檢為依據(jù)逐區(qū)調(diào)查發(fā)病蠶、健康蠶。有血液型膿病典型病癥的蠶，計為發(fā)病蠶；沒有典型病癥的3齡起蠶記為健康蠶。對不能確定的蠶，取血液用光學顯微鏡檢查，觀察到有家蠶核型多角體，則計入發(fā)病蠶。家蠶血液型膿病發(fā)病時，多為不眠蠶，體壁緊張發(fā)亮，有狂躁爬行、環(huán)節(jié)和節(jié)間膜腫脹、血液渾濁等典型病狀，最后體壁破裂而死。如圖：發(fā)病率計算公式 a=b/(b＋c)×100％ 式中：a——發(fā)病率,單位為百分比（％）；b——發(fā)病蠶頭數(shù)，單位為頭（頭）；c——健康蠶頭數(shù),單位為頭（頭）；結(jié)果記錄如實準確及時記錄測試結(jié)果并傳遞測試結(jié)果，根據(jù)測試結(jié)果，選留發(fā)病率低的蠶區(qū)繼續(xù)飼育，淘汰發(fā)病率高的蠶區(qū)。選留蠶區(qū)的后續(xù)飼養(yǎng)、上蔟制種按DB45/T83執(zhí)行；蠶種的保護、浸酸、冷藏和浸酸按DB45/T84《桑蠶種保護、冷藏、浸酸技術(shù)規(guī)程》執(zhí)行。清洗消毒用具、蠶室進行消毒清洗按DB45/T83《種繭育養(yǎng)蠶技術(shù)規(guī)程規(guī)定執(zhí)行》。六、國內(nèi)同類標準制修訂情況及與法律法規(guī)、強制性標準關(guān)系經(jīng)查閱，國內(nèi)沒有與家蠶抗血液型膿病性能跟蹤測試直接相關(guān)的標準，其他相關(guān)如下：NY/T3421-2019《家蠶核型多角體病毒檢測熒光定量PCR法》主要規(guī)定了家蠶核型多角體病毒的實時熒光定量PCR檢測方法。NY/T3152.3-2017《微生物農(nóng)藥環(huán)境風險評價試驗準則第3部分：家蠶毒性試驗》規(guī)定了微生物農(nóng)藥對家蠶毒性試驗的操作、條件等要求。DB33/T2183-2019《家蠶核型多角體病抗性鑒定方法》主要規(guī)定了家蠶一代雜交種對核型多角體病抗性水平的評價。DB51/T1207-2011《桑蠶血液型膿病診