GB-T 39917-2021 主要農(nóng)作物品種真實(shí)性和純度SSR分子標(biāo)記檢測 稻

主要農(nóng)作物品種真實(shí)性和純度SSR分子標(biāo)記檢測稻國家市場監(jiān)督管理總局國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)I Ⅲ 13.2縮略語 2 2 2 2 35.3檢測平臺(tái) 3 35.5檢測條件 4 46.1儀器設(shè)備 46.2試劑 5 5 57.1引物合成 5 8 97.4擴(kuò)增產(chǎn)物分離 7.5數(shù)據(jù)分析 8品種純度檢測程序 8.2引物篩選和合成 8.4擴(kuò)增產(chǎn)物分離 8.5數(shù)據(jù)分析 9結(jié)果計(jì)算與表示 9.1真實(shí)性鑒定 9.2純度測定 ⅡGB/T39917—2021附錄A(規(guī)范性附錄)溶液配制 附錄B(資料性附錄)等位基因擴(kuò)增片段信息 表1真實(shí)性鑒定引物 表3純度測定候選引物 表B.1已知品種主要等位基因擴(kuò)增片段信息 Ⅲ1本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了稻(OryzasativaL.)品種GB/T3543.1農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程總則GB/T3543.2農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程扦樣GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格2能夠組合在一起電泳的，具有不同顏色或相同顏色而擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小不同的熒光標(biāo)記的一組CTAB:cetyltrimethylammoniumbrodNTPs:deoxyribonucleosidetriphosphates,脫氧核苷三磷酸。SDS:sodiumdodecylsu稻的不同品種，其基因組存在著能夠世代穩(wěn)定遺傳3了已知品種的SSR指紋數(shù)據(jù)比對(duì)平臺(tái)。表1引物可分為I、Ⅱ兩組，編號(hào)PR01～PR24為I組，編號(hào)較高，可采用序貫方式，也可直接采用表1的48對(duì)SSR引5.3.1電泳是檢測的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對(duì)于真實(shí)性鑒定，可選擇采用PAGE電泳、毛細(xì)管電泳，但應(yīng)注意以采用PAGE電泳、毛細(xì)管電泳，在選擇等位基因擴(kuò)增片段差異較大的引物前提下也可采用瓊脂糖4稻穗，數(shù)量應(yīng)不低于10個(gè)(總粒數(shù)不少于1000粒)。少含有20個(gè)個(gè)體，單個(gè)個(gè)體試樣應(yīng)至少含有5個(gè)個(gè)體。6.1.3.2PAGE電泳56.2.2PCR擴(kuò)增編號(hào)引物名稱(位置bp)退火溫度℃引物序列(5′—3)熒光6編號(hào)引物名稱染色體(位置bp)退火溫度℃引物序列(5′—3)熒光7編號(hào)引物名稱染色體(位置bp)退火溫度C引物序列(5′—3熒光8編號(hào)引物名稱染色體(位置bp)退火溫度℃引物序列(5′—3)熒光DNA提取方法應(yīng)保證提取的DNA質(zhì)量符合PCR擴(kuò)增的要求，DNA無降解，溶液的紫外光吸光97.3PCR擴(kuò)增PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的總體積和組分的終濃度參照表2進(jìn)行配量，可以依據(jù)試驗(yàn)條件不同做相應(yīng)調(diào)整。表2中的緩沖液若含有MgCl?,不再加MgCl?溶液，加等體積無菌水替代。原濃度終濃度10×緩沖液1Taq酶引物11每一種類的濃度。b)擴(kuò)增：94℃變性45s,50℃~67℃(根據(jù)表1的引物設(shè)定退火溫度)退火45s,72℃延伸取10μL擴(kuò)增產(chǎn)物(見7.3.2),加入2μL6×加樣緩沖液，混勻。在PCR擴(kuò)增儀上運(yùn)行95膠溫度保持在約50℃。電泳時(shí)間的確定執(zhí)行7.4.1.2.2的規(guī)定。將附著凝膠的長玻璃板放入固定液中，輕搖3min;用水快速漂洗，再取出放入染色液中輕搖(見7.3.2),充分混勻。從混合液中吸取1μL,加入DNA分析儀專用96孔板孔中。各孔再分別加入10min以上。瞬時(shí)離心10s后供備用。a)對(duì)于連帶(pull-up)峰，即因某一位置某一顏色熒光的峰值較高而引起同一位置其他顏色熒光7.5.1.3對(duì)于PAGE電泳，位于其相應(yīng)的等位基因擴(kuò)增片段大小范圍7.5.1.4采用混合樣檢測，無論是毛細(xì)管電泳還是PAGE電泳，結(jié)果表選擇少量的對(duì)照),校準(zhǔn)不同電泳板間的數(shù)據(jù)偏差后再讀取擴(kuò)增片段大小。甄別后的特異峰落入Bin范純合位點(diǎn)數(shù)據(jù)記錄為X/X,雜合位點(diǎn)數(shù)據(jù)記錄為X/Y(其中X、Y分別為該位點(diǎn)兩個(gè)等位基因擴(kuò)增片7.5.3.2采用毛細(xì)管電泳與SSR指紋數(shù)據(jù)比對(duì)平臺(tái)比對(duì)的，按照數(shù)據(jù)導(dǎo)入模板的要求編號(hào)引物染色體(位置bp)退火溫度℃引物序列(5′—3')熒光-—送驗(yàn)樣品低于5.4.1.1規(guī)定數(shù)量的； 其他類型雜株個(gè)體個(gè)?！獧z測采用了其他SSR引物的名稱及序列。溶液配制Na?EDTA·2H?O186.1g溶于800mL水中，加固體NaOH調(diào)pH至8.0,加水定容至1000mL,A.1.30.5mol/LHCI溶液濃鹽酸(36%～38%)25mL,加水定容至500mL。A.1.45mol/LNaCI溶液A.1.5CTAB提取液用TE緩沖液分別配制正向引物和反向引物至濃度為5μmol/L的工作液。固體MgCl?1.19g,加水定容至500mL。高壓滅菌，-20℃保存。A.3電泳A.3.26.0%PAGE膠A.3.5疏水硅烷工作液2%二甲基二氯硅烷。0.25g過硫酸銨溶于1mL超純水中。10×TBE緩沖液500mL,加水定容至5000A.3.96×溴酚藍(lán)-二甲苯青電泳指示劑50×TAE緩沖液100mL,加水定容至5000mL。A.4銀染溶液冰醋酸100mL,加水定容至1000mL。A.4.2染色液硝酸銀1.0g,加水定容至1000mL。固體NaOH15g和甲醛5mL,加水定容至1000mL。引物參照樣品川7號(hào)白芒稻元子占稻天優(yōu)華占川7號(hào)川7號(hào)安育早1號(hào)元子占稻川7號(hào)引物參照樣品陸川早1號(hào)川7號(hào)宜香101旱輪稻陸川早1號(hào)元子占稻天優(yōu)華占輪回01引物參照樣品白芒稻輪回01白芒稻天優(yōu)華占引物參照樣品中秈168陸川早1號(hào)川7號(hào)昌米011天優(yōu)華占引物參照樣品輪回01川7號(hào)輪回01陸川早1號(hào)宜香101輪回01元子占稻川7號(hào)引物參照樣品元子占稻旱輪稻輪回01陸川早1號(hào)元子占稻輪回01天優(yōu)華占陸川早1號(hào)引物參照樣品白芒稻輪回01陸川早1號(hào)輪回01元子占稻陸川早1號(hào)川7號(hào)川7號(hào)引物參照樣品元子占稻宜香101輪回01輪回01元子占稻川7號(hào)引物參照樣品宜香101元子