(高清版)GB∕T 38421-2019 毛皮 源性成分檢測 實時熒光定性聚合酶鏈式反應（PCR）檢測方法

Y46中華人民共和國國家標準毛皮源性成分檢測實時熒光定性國家市場監(jiān)督管理總局國家標準化管理委員會ⅠGB／T38421—2019本標準按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標準由中國輕工業(yè)聯(lián)合會提出。本標準由全國皮革工業(yè)標準化技術委員會(SAC/TC252)歸口。本標準起草單位：廣州檢驗檢測認證集團有限公司、國家皮革質量監(jiān)督檢驗中心（浙江）、深圳華大基因科技服務有限公司、浙江方圓檢測集團股份有限公司、中國皮革制鞋研究院有限公司、陜西科技大學、中國計量大學、東莞市惟思德科技發(fā)展有限公司。本標準主要起草人：覃芳芳、黃新霞、孫海陸、陳宗良、王學川、馮愛明、張弛、孫霞、趙洋、章文福。1GB／T38421—2019毛皮源性成分檢測實時熒光定性PCR本標準規(guī)定了天然毛皮中動物源性成分定性分析的實時熒光PCR檢測方法。本標準適用于八種天然毛皮（水貂、兔、貉子、浣熊、馬、牛、山羊和綿羊）的源性成分定性檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T19495.2轉基因產(chǎn)品檢測實驗室技術要求GB/T21102—2007動物源性飼料中兔源性成分定性檢測方法實時熒光PCR方法GB/T25165—2010明膠中牛、羊、豬源性成分的定性檢測方法實時熒光PCR法3術語和定義、縮略語下列術語和定義適用于本文件。在聚合酶鏈式反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號的積累，實時監(jiān)控整個PCR進程，并通過擴增曲線對未知模板進行定性分析的方法。注：改寫GB/T19495.4—2018,定義3.1.2。3.1.2每個反應管內的熒光信號達到設定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。[GB/T19495.4—2018,定義3.1.5]下列縮略語適用于本文件。DTT：二硫蘇糖醇(dithiothreitol)2GB／T38421—2019提取動物毛皮試樣中的DNA,針對水貂、兔、貉子、浣熊、馬、牛、山羊、綿羊物種特異性的內源基因序列設計引物，通過特異性引物和標記熒光物質探針，對動物源性的DNA進行實時熒光PCR擴增，根據(jù)PCR擴增反應中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的強弱判定，實現(xiàn)對毛皮中動物源性成分的定性分析。5試劑和材料5.1一般規(guī)定：除非另有說明，所用試劑均為分析純，試驗用水應符合GB/T6682中一級水的規(guī)定。5.2滅菌水。5.5鹽酸(HCl)。5.6乙二胺四乙酸鈉鹽(Na2EDTA)。5.7十二烷基硫酸鈉(SDS)。5.8氯化鈉。5.9乙酸鈉。5.12二硫蘇糖醇(DTT)。5.14三氯甲烷。5.15異丙醇。5.16無水乙醇。5.25DNA吸附柱。GB／T38421—20195.26DNA提取試劑盒。表1引物和探針信息引物名稱目標基因內參引物探針a正向CCTGAGAAACGGCTACCAT真核生物18SrRNA基因（內參基因）反向CGTGTCAGGATTGGGTAAT探針(FAM)TGCGCGCCTGCTGCCTTCCT(TAMRA)水貂引物探針正向CCACTAACATCATCCATCACCA水貂內源基因（線粒體基因）反向AATGAGTGGGTAGGGCATGG探針(FAM)CTCCCATCCTAGCCCTAACACTAGCCCTT(TAMRA)兔引物探針b正向TAATCGTCACCGCACATGCC兔內源基因（線粒體基因）反向CTATGTCAGGAGCCCCAATTATCA探針貉子引物探針正向CCTATCCCTCTCCCACGTATGAA貉子內源基因（線粒體基因）反向TTAGGGATGAAACCGGATAGTGG探針(FAM)CATTGATAACCTCCGTCATCCTGGCCC(TAMRA)浣熊引物探針正向GCTGACTTCCAATCAACTAGTTCTG浣熊內源基因（線粒體基因）反向AGCTGTGGTAATCAGAACGCGAT探針(FAM)CCTACTTACCAACACACTCCTAGCCTCC(TAMRA)馬引物探針正向CTTCAACCCCACAGCGTCCATCA馬內源基因（線粒體基因）反向AGCGATCATCATTAACCTCATACAC探針(FAM)TACTCAGAAGTGGAATGGTGTGAG(TAMRA)牛引物探針c正向CCGATGGATGTTCAGAGCT牛內源基因（生長激素基因）反向GCCAAATGTCTGGGTGTAGATACC探針(FAM)TGGGCTTTAGGGCTTCCGAATGTGAA(TAMRA)山羊引物探針正向TGCACTAACCACCCTAACCCTAT山羊內源基因（線粒體基因）反向AAAGGCACATGAAACGACCGT探針(FAM)CCGCACCCATCATAATAACCAACCTCAAT(TAMRA)綿羊引物探針dACACAACTTCTACCACAACCC綿羊內源基因（線粒體基因）AAACAATGAGGGTAACGAGGG(FAM)ACACCGAAACAAAATACTCCTTGAGAAACA(TAMRA)a該引物和探針見GB/T25165—2010。b該引物和探針見GB/T21102—2007。c該引物和探針見GB/T25165—2010。d該引物和探針見GB/T25165—2010。34GB／T38421—20196儀器與設備6.3高壓滅菌鍋。6.5恒溫水浴箱。6.6渦旋振蕩器。6.7高速冷凍離心機。6.9超微量核酸蛋白分析儀。6.10超凈工作臺。7試驗步驟7.1DNA提取上清液重復操作一次。重復操作一次。。DNA取上清液，即為試樣DNA溶液，待測。注：除上述方法外，也可用等效的DNA提取方法提取試樣DNA。5GB／T38421—20197.1.2陰性對照模板DNA提取以濾紙代替試樣，按7.1.1的方法提取DNA溶液，作為PCR擴增的陰性對照。7.1.3DNA質量評估若同時滿足以下要求則適宜PCR擴增：若按照7.1.1的方法提取的試樣DNA不能滿足以上要求時，應將DNA進一步純化。注：可根據(jù)試樣的具體情況選擇苯酚-三氯甲烷抽提、DNA純化柱等方式進行純化。7.2實時熒光PCR檢測可先將試樣DNA進行內參基因的實時熒光PCR檢測，若檢測結果為陽性，表明提取的試樣DNA適宜進行PCR檢測，可以進行動物內源基因的檢測；若檢測結果為陰性，表明提取的DNA不適宜進行PCR檢測，應重新提取DNA。若重新檢測結果仍為陰性，則本方法不適用于該試樣檢測。7.2.2實時熒光PCR擴增體系為確保檢測結果的準確性，在進行試樣檢測時，應同時設立空白對照、陰性對照和陽性對照試驗。在超凈工作臺(6.10)中按表2配制實時熒光PCR擴增體系，每個試樣DNA的PCR平行擴增PCR試劑名稱體積dNTPs(2.5mmol/L)模板DNA滅菌水注1：空白對照試驗時，用滅菌水(5.2)代替試樣DNA。注2：陰性對照試驗時，用模板DNA(7.1.2)代替試樣DNA。注3：陽性對照試驗時，用水貂、兔、貉子、浣熊、馬、牛、山羊和綿羊基因組DNA(5.28)。6GB／T38421—2019PCR混勻離心后置于實時熒光PCR儀上進行PCR擴增，PCR擴增參數(shù)根據(jù)不同儀器有所不同。一般每個試樣應至少平行試驗2次。8結果分析否則判定為PCR無效。8.1.2DNA提取有效性判定取內參照引物對試樣DNA提取液進行PCR擴增，在符合8.1.1的情況下，被檢測試樣DNA應有8.2動物內源基因的檢測結果判定在符合8.1.2的情況下，對試樣DNA提取液進行各動物內源基因的實時熒光PCR擴增檢測：正常，則判斷該試樣未檢出該動物源性成分。9結果表述試樣DNA內參基因的檢測結果為陰性，則表述為“該試樣不適用于本方法檢測”。試樣DNA內參基因的檢測結果為陽性且某種動物（如水貂