2024人體糞便樣本中溶藻弧菌檢測

人體糞便樣本中溶藻弧菌檢測PAGEPAGE14人體糞便樣本中溶藻弧菌檢測范圍本文件描述了人體糞便樣本中溶藻弧菌的檢測方法。本文件適用于人體糞便樣本中溶藻弧菌的檢測。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4.136℃±1℃。4.250℃±1℃。實(shí)時熒光PCR12000r/min。100μL～2μL2μL～10μL10μL～20μL20μL～200μL、100μL～1000μL。無核酸酶PCR10μL、1μL。90mm。mm。5001000。實(shí)驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T6682三級水的要求Cary-BlairAA.13AA.2（TCBS）A中A.33AA.4AA.5AA.63AA.7AA.83AA.93AA.103Voges-Proskauer（V-P）AA.11V-PAA.12ONPGAA.13DNA熒光PCR2×PremixExTaqTMα4（CHCA）AA.1422mL～5mL2h內(nèi)2Cary-Blair24h從樣本盒中挑取黃豆粒大小糞便樣本(水樣便大約取300μL～500μL),加入到10mL的3%氯化鈉堿性蛋白胨水中，充分混勻，36℃±1℃增菌培養(yǎng)8h～18h；肛拭子從運(yùn)送培養(yǎng)基中取出，直接放入10mL的3%氯化鈉堿性蛋白胨水中，充分震蕩，36℃±1℃增菌培養(yǎng)8h～18h。取增菌液劃線接種于TCBS瓊脂和弧菌顯色培養(yǎng)基，于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。典型的溶藻弧菌菌落在TCBS瓊脂上呈圓形、表面光滑、大而扁平的黃色菌落，直徑2mm～3mm。在弧菌顯色培養(yǎng)基上的菌落特征參照產(chǎn)品說明書進(jìn)行判定。在TCBS53，36℃±118h～24。6.43%6.43%s6.43%菌落，接種3%36℃±1℃培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。溶藻弧菌在3用接種針從6.430%、3%、6%、810，36℃±124h3%68103%36±1h～24h3V-P培養(yǎng)基，36℃±1℃培養(yǎng)24h～48h3%36℃±1℃培養(yǎng)18h～24hONPG注：如選擇生化鑒定試劑盒或全自動微生物生化鑒定系統(tǒng),從3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板上挑取菌落,用生理鹽水制備成濁度適當(dāng)?shù)木鷳乙?使用生化鑒定試劑盒或全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。溶藻弧菌生化反應(yīng)及與其它弧菌的鑒別見表1。表1溶藻弧菌生化反應(yīng)及與其它弧菌的鑒別名稱氧化酶賴氨酸精氨酸鳥氨酸明膠脲酶V︱P42℃生長蔗糖D︱纖維二糖乳糖阿拉伯糖D︱甘露糖D︱甘露醇ONPG嗜鹽性試驗(yàn)氯化鈉含量（%）036810溶藻弧菌V.alginolyticus＋＋－＋＋－＋＋＋－－－＋＋－－＋＋＋＋副溶血性弧菌V.parahaemolyticus＋＋－＋＋V－＋－V－＋＋＋－－＋＋＋－創(chuàng)傷弧菌V.vμLnificus＋＋－＋＋－－＋－＋＋－＋V＋－＋＋－－霍亂弧菌V.cholerae＋＋－＋＋－V＋＋－－－＋＋＋＋＋－－－擬態(tài)弧菌V.mimicus＋＋－＋＋－－＋－－－－＋＋＋＋＋－－－河弧菌V.fluvialis＋－＋－＋－－V＋＋－＋＋＋＋－＋＋V－弗氏弧菌V.furnissii＋－＋－＋－－－＋－－＋＋＋＋－＋＋＋－表1溶藻弧菌生化反應(yīng)及與其它弧菌的鑒別(續(xù))名稱氧化酶賴氨酸精氨酸鳥氨酸明膠脲酶V︱P42℃生長蔗糖D︱纖維二糖乳糖阿拉伯糖D︱甘露糖D︱甘露醇ONPG嗜鹽性試驗(yàn)氯化鈉含量（%）036810梅氏弧菌V.metschnikovii－＋＋－＋－＋V＋－－－＋＋＋－＋＋V－霍利斯弧菌V.hollisae＋－－－－－－nd－－－＋＋－－－＋＋－－注：＋表示陽性；－表示陰性；nd表示未試驗(yàn)；V表示可變。PCRDNA6.4500μL1.5mL1012000r/min離心5（DNAPCR-201注：可用商品化的細(xì)菌DNA提取試劑盒，按說明書操作。PCR實(shí)時熒光PCR反應(yīng)體系體積為20μL：2×PremixExTaqTM10μL、上下游引物(10μmol/L)各0.5μL10μmol/L)0.5μLDNA2μL,20μL反應(yīng)參數(shù)：95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s、60℃退火延伸20s、循環(huán)40次，在退火階段檢測熒光。注：可采用效果等同經(jīng)過驗(yàn)證的商品化溶藻弧菌熒光PCR檢測試劑盒，操作方法及結(jié)果判定按試劑盒說明書進(jìn)行。表2溶藻弧菌實(shí)時熒光PCR引物和探針序列及產(chǎn)物長度引物核苷酸序列(5'-3')產(chǎn)物長度COLFGTGGCTTACACGTTGGAATGATCCOLRTTTGGCAAGGTCTGTTTGGTTAC142bpCOLPHEX－CACAAATTGCTCGTTCCACTGCCCACC－BHQ1PCRDNA片段的質(zhì)粒DNADNA，PCRPCR值≤HEX型的S；35＜Ct值≤40Ct值HEXSPCR基質(zhì)輔助激光解吸飛行時間質(zhì)譜（matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtime-of-flightmassspectrometry，MALDI-TOFMS)鑒定選擇線性操作模式，正離子模式，質(zhì)譜掃描范圍：2000Da-20000Da；激光點(diǎn)擊數(shù)：每圖譜40次(6次激光累積)；激光頻率：60.0Hz；離子源加速電壓：20kV。ATCC873911使用1μL接種環(huán)挑取6.41μLCHCA/MALDI-TOFMS10根據(jù)6.5.1或6.5.2或6.5.3樣本檢測和廢棄物處理按照GB19489規(guī)定執(zhí)行。附錄A（）Cary-Blair硫乙醇酸鈉1.5g磷酸氫二鈉1.1g氯化鈉5.0g氯化鈣0.09g瓊脂5.0g蒸餾水1000.0mL15。3蛋白胨10.0g氯化鈉30.0g蒸餾水1000.0mL將各成分溶于蒸餾水中，校正pH至8.5±0.2，121℃高壓滅菌10min。（TCBS）蛋白胨10.0g酵母浸膏5.0g檸檬酸鈉10.0g硫代硫酸鈉10.0g氯化鈉10.0g牛膽汁粉5.0g檸檬酸鐵1.0g膽酸鈉3.0g蔗糖20.0g溴麝香草酚藍(lán)0.04g麝香草酚藍(lán)0.04g瓊脂15.0g蒸餾水1000.0mL3胰蛋白胨15.0g大豆蛋白胨5.0g氯化鈉30.0g瓊脂15.0g蒸餾水1000.0mL成分結(jié)晶紫1.0g95％乙醇20.0mL1％草酸銨水溶液80.0mL制法將結(jié)晶紫完全溶解于乙醇中，然后與草酸銨溶液混合。成分碘1.0g碘化鉀2.0g蒸餾水300.0mL將碘與碘化鉀先進(jìn)行混合，加入蒸餾水少許充分振搖，待完全溶解后，再加蒸餾水至300mL。沙黃0.25g95％乙醇10.0mL蒸餾水90.0mL將沙黃溶解于乙醇中，然后用蒸餾水稀釋。111成分N，N，N’，N’-四甲基對苯二胺鹽酸鹽1.0g蒸餾水1000.0mL7ds3蛋白胨15.0g?蛋白胨5.0g牛肉膏3.0g酵母浸膏3.0g氯化鈉30.0g乳糖10.0g蔗糖10.0g葡萄糖1.0g硫酸亞鐵0.2g苯酚紅0.024g硫代硫酸鈉0.3g瓊脂12.0g蒸餾水1000.0mL42。胰蛋白胨10.0g氯化鈉按不同量加入蒸餾水1000.0mL5。3牛肉膏5.0g蛋白胨10.0g氯化鈉30.0g磷酸氫二鈉2.0g甘露醇5.0g溴麝香草酚藍(lán)0.024g蒸餾水1000.0mL滅菌10min。3蛋白胨5.0g酵母浸膏3.0g葡萄糖1.0g溴甲酚紫0.02gL-賴氨酸5.0g氯化鈉30.0g蒸餾水1000.0mL至5。h3V-P多胨7.0g葡萄糖5.0g磷酸氫二鉀5.0g氯化鈉30.0g蒸餾水1000.0mL將A.9.1中成分溶于蒸餾水中，校正pH至6.9±0.2，分裝試管，121℃高壓滅菌15min。V-P甲液α-萘酚5.0g無水乙醇100.0mL乙液氫氧化鉀40.0g用蒸餾水加至100.0mLVP13hONPG成分磷酸氫二鈉6.9g蒸餾水加至50.0mL制法將磷酸二氫鈉溶于蒸餾水中，校正pH至7.0。緩沖液置2℃～5℃冰箱保存。ON