(高清版)GB∕T 37874-2019 核酸提取純化方法評(píng)價(jià)通則

ICS07.080G00中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)核酸提取純化方法評(píng)價(jià)通則Gvx2019-08-30發(fā)布2019-08-30實(shí)施國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局ⅠGB／T37874—2019 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語(yǔ)和定義、縮略語(yǔ) 4基本要求 5指標(biāo)參數(shù) 6評(píng)價(jià)方法 ⅢGB／T37874—2019本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中國(guó)科學(xué)院北京基因組研究所、中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：孟慶姝、傅博強(qiáng)、胡松年、葛曉萌、談昕煜、牛春艷、畢小春。GB／T37874—2019核酸提取純化方法評(píng)價(jià)通則本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了核酸提取純化方法評(píng)價(jià)的指標(biāo)參數(shù)和評(píng)價(jià)方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室對(duì)于常規(guī)樣本（新鮮樣本）的核酸（基因組DNA與總RNA)提取純化方法的一般性評(píng)價(jià)。本標(biāo)準(zhǔn)不適用于病毒核酸的提取，游離DNA的提取，陳舊樣本、微量樣本與高度降解樣本核酸的提取方法的評(píng)價(jià)，也不適用于在提取過(guò)程中通過(guò)添加外源DNA或RNA以提高提取效率的核酸提取方法的評(píng)價(jià)。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修訂單）適用于本文件。)3術(shù)語(yǔ)和定義、縮略語(yǔ)下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3′5′-功能，主要是貯存遺傳信息和傳遞遺傳信息。包括核糖核酸(RNA)和脫氧核糖核酸(DNA)兩類。[JJF1265—2010,定義4.42]具有足夠均勻和穩(wěn)定的特定特性的物質(zhì)，其特性被證實(shí)適用于測(cè)量中或標(biāo)稱特性檢查中的預(yù)期用途。[JJF1001—2011,定義8.14]下列縮略語(yǔ)適用于本文件。12GB／T37874—2019RNA：核糖核酸(RibonucleicAcid)4基本要求常規(guī)的用于分子生物學(xué)提取核酸的樣本主要包括新鮮的動(dòng)植物組織樣本、細(xì)胞樣本、血液樣本、唾液樣本和糞便樣本等。宜選用新鮮樣本進(jìn)行核酸提取；若不能馬上提取，應(yīng)分裝成小份，按照樣本特性與采集情況妥善保存。5指標(biāo)參數(shù)核酸完整度表征提取過(guò)程中保持核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)（序列）完整而不發(fā)生改變的程度。在核酸提取時(shí)應(yīng)盡量防止物理（剪切力、高溫）、化學(xué)因素（強(qiáng)酸、強(qiáng)堿）和生物因素（核酸酶）的破壞。根據(jù)試驗(yàn)條件和核酸樣品，可以選擇瓊脂糖凝膠電泳方法進(jìn)行核酸完整度測(cè)定，根據(jù)條帶位置和不同條帶的熒光亮度分析綜合計(jì)算評(píng)價(jià)核酸的完整性。5.1.2DNA完整度用瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)，完整基因組DNA電泳結(jié)果為一條清晰明亮的條帶，條帶拖尾或者彌散代表DNA有部分降解。5.1.3總RNA完整度5.1.3.1真核生物總RNA完整度用瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)，真核生物完整的總RNA電泳結(jié)果為清晰的兩條條帶-28S和18S-核糖后續(xù)試驗(yàn)的要求。5.1.3.2原核生物總RNA完整度用瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)，原核生物完整的總RNA電泳結(jié)果為清晰的兩條條帶-23S和16S-核糖度可以滿足絕大部分后續(xù)試驗(yàn)的要求。用瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)，如果電泳條帶彌散，沒(méi)有清晰的核糖體RNA條帶，為部分降解的RNA樣品；電泳條帶呈現(xiàn)極低分子質(zhì)量處的彌散狀，為完全降解的RNA樣品。5.2提取產(chǎn)量提取產(chǎn)量是指單位樣本中提取得到的核酸(DNA或RNA)的總質(zhì)量。該指標(biāo)用于表征提取得率。3GB／T37874—2019取量，計(jì)算得率。計(jì)算公式與參考得率見(jiàn)6.2.3。5.3核酸純度核酸純度是指核酸提取物中目標(biāo)核酸的純度，該指標(biāo)用于表征核酸提取物中目標(biāo)核酸與殘留雜質(zhì)的相對(duì)含量，對(duì)于后續(xù)的分子生物學(xué)試驗(yàn)有重要的影響。核酸在特定波長(zhǎng)的吸光度值及其在不同波長(zhǎng)吸光度值的比率對(duì)不同性質(zhì)的核酸有對(duì)應(yīng)的特征值，用以表征提取液的核酸純度。用紫外分光光度計(jì)5.3.2DNA純度分子雜質(zhì)。5.3.3RNA純度小分子雜質(zhì)。6評(píng)價(jià)方法6.1瓊脂糖凝膠電泳法評(píng)價(jià)核酸完整度配制與核酸類型及電泳儀規(guī)格相匹配的瓊脂糖凝膠；取合適濃度的核酸樣品溶液與核酸上樣緩沖液混合；電泳至合適位置；用凝膠成像系統(tǒng)觀察核酸條帶。6.2熒光定量法評(píng)價(jià)核酸提取產(chǎn)量熒光定量試劑盒。GB／T37874—2019應(yīng)符合ISO8655-2:2002的要求。首先根據(jù)樣品選擇適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)物質(zhì)校準(zhǔn)熒光定量?jī)x。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在使用前需要現(xiàn)用現(xiàn)配（稀釋標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與熒光染料充分混合后需孵育適當(dāng)?shù)臅r(shí)間（按儀器使用指南操作）。檢測(cè)時(shí)取待測(cè)核酸提取純化樣品與熒光染料混合均勻，室溫孵化后檢測(cè)熒光，回歸曲線分析得到檢測(cè)結(jié)果。為保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，每個(gè)樣品應(yīng)重復(fù)檢測(cè)三次，從與熒光染料的混合開(kāi)始。然后根據(jù)式(1)計(jì)算核酸提取純化產(chǎn)物產(chǎn)量。n式中：i—i對(duì)于幾種常見(jiàn)的生物樣本，合格的核酸提取純化方法的參考得率（最低標(biāo)準(zhǔn)）為：6.3紫外吸光法評(píng)價(jià)核酸純度核酸樣品溶解液。6.3.2.1紫外分光光度儀：b)波長(zhǎng)準(zhǔn)確度