(高清版)GB∕T 14701-2019 飼料中維生素B2的測(cè)定

GB/T14701—2019飼料中維生素B2的測(cè)定2019-06-04發(fā)布2020-01-01實(shí)施國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)IGB/T14701—2019本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)代替GB/T14701—2002《飼料中維生素B?的測(cè)定》。本標(biāo)準(zhǔn)與GB/T14701—2002相比，主要技術(shù)內(nèi)容修改如下：——修改了方法1、方法2適用范圍以及檢出限、定量限(見(jiàn)第1章，2002年版的第1章);--——規(guī)定了不同飼料類(lèi)型的仲裁法(見(jiàn)第1章，2002年版的第1章);——補(bǔ)充了維生素B?紫外檢測(cè)色譜條件下和熒光檢測(cè)色譜條件下的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖(見(jiàn)附錄A圖A.1和圖A.2)。本標(biāo)準(zhǔn)由全國(guó)飼料工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(SAC/TC76)提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所[國(guó)家飼料質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心(北京)]。本標(biāo)準(zhǔn)所代替標(biāo)準(zhǔn)的歷次版本發(fā)布情況為： GB/T14701—1993、GB/T14701—2002。1GB/T14701—2019飼料中維生素B?的測(cè)定1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了飼料中維生素B?(即核黃素C??H??N?o)測(cè)定的熒光分光光度法和高效液相色譜法。0.25mg/kg。濃縮飼料中維生素B?的測(cè)定，方法1為仲裁法；維生素預(yù)混合飼料、添加劑預(yù)混合飼料中維生素B?的測(cè)定，方法2中的高效液相色譜熒光檢測(cè)器方法為仲裁法。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T14699.1飼料采樣GB/T20195動(dòng)物飼料試樣的制備維生素B?(核黃素)在440nm紫外光激發(fā)下產(chǎn)生綠色熒光，在一定濃度范圍內(nèi)其熒光強(qiáng)度與核黃素含量成正比。用連二亞硫酸鈉還原核黃素成無(wú)熒光物質(zhì)，由還原前后熒光強(qiáng)度之差與熒光強(qiáng)度的比值計(jì)算樣品中維生素B?的含量。除非另有說(shuō)明，所用試劑均為分析純?cè)噭疄檎麴s水，符合GB/T6682中三級(jí)用水或相當(dāng)純度3.2.5連二亞硫酸鈉(Na?S3.2.7冰乙酸。3.2.10維生素B?標(biāo)準(zhǔn)溶液2GB/T14701—20193.2.10.1維生素B2貯備液I:稱(chēng)取在五氧化二磷干燥器里干燥24h的維生素B2標(biāo)準(zhǔn)品(純度大于95%)25mg(精確至0.0001g)于250mL棕色錐形瓶中，加入約200mL冰乙酸溶液(3.2.8),在沸水浴蓋，2℃~8℃冰箱保存，保存期6個(gè)月。該溶液含0.1mg/mL維生素B?。3.2.10.2維生素B?貯備液Ⅱ:取維生素B?貯備液I(3.2.10.1)10mL用冰乙酸溶液(3.2.8)稀釋至100mL,置于棕色容量瓶中滴加甲苯覆蓋，2℃~8℃冰箱保存，保存期3個(gè)月。該溶液中含10μg/mL3.2.11.1熒光素貯備液：稱(chēng)取熒光素0.050g,用水稀釋至1000mL,置于棕色瓶中2℃~8℃冰箱保3.2.11.2熒光素標(biāo)準(zhǔn)工作液：取1mL熒光素貯備液(3.2.11.1),用水定容至1000mL,置于棕色瓶中2℃~8℃冰箱保存。該溶液中含0.05μg/mL熒光素。3.2.12溴甲酚綠pH指示劑取溴甲酚綠0.1g,加氫氧化鈉溶液(3.2.1)2.8mL溶解，再加水稀釋至200mL。變色范圍3.3.1分析天平：感量0.0001g。3.3.4熒光分光光度計(jì)。按GB/T14699.1的規(guī)定，選取具有代表性的樣品至少500g,用四分法縮減至100g;按以下操作應(yīng)避免強(qiáng)光照射。入65mL鹽酸溶液(3.2.3),于沸水浴中煮沸30min。在加熱開(kāi)始時(shí)，每隔5min～10min搖動(dòng)錐形瓶(3.2.4)使pH值調(diào)至4.5(溴甲酚綠指示劑變?yōu)椴菥G色)。轉(zhuǎn)移至100mL棕色容量瓶中，用水稀釋至刻度。通過(guò)中速無(wú)灰濾紙過(guò)濾，棄去最初5mL～10mL溶液，收集濾液于100mL棕色錐形瓶中。取整入水1mL,向試管b中加入維生素B?標(biāo)準(zhǔn)工作液(3.2.10.3)1mL。然后各加入冰乙酸(3.2.7)1mL,3GB/T14701—2019旋搖混勻后逐個(gè)加高錳酸鉀溶液(3.2.6)0.5mL,旋搖混勻，靜置2min,再逐個(gè)加入過(guò)氧化氫溶液(3.2.9)0.5mL旋搖，使高錳酸鉀顏色在10s內(nèi)消退。加蓋搖動(dòng)，使氣泡逸出。用熒光素標(biāo)準(zhǔn)工作液(3.2.11.2)調(diào)整熒光儀，使其穩(wěn)定于一定數(shù)值，作為儀器工作的固定條件。調(diào)整激發(fā)波長(zhǎng)440nm,發(fā)射波長(zhǎng)525nm,測(cè)定試管a、試管b的熒光強(qiáng)度，試樣溶液在儀器中受激發(fā)照射不超過(guò)10s;在試管c中加入20mg連二亞硫酸鈉(3.2.5),搖動(dòng)溶解，并使試管中的氣體逸出，迅速測(cè)定其熒光強(qiáng)度作為熒光空白。若溶液出現(xiàn)渾濁，不能讀數(shù)。3.6試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理試樣中維生素B?的含量w;以質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示，單位為毫克每千克(mg/kg),按式(1)計(jì)算：……(1)式中：T?——試管a(試液加水)的熒光強(qiáng)度；T?——試管b(試液加標(biāo)樣)的熒光強(qiáng)度；T?——試管c(試液加連二亞硫酸鈉)的熒光強(qiáng)度；m?——加入維生素B?標(biāo)樣的量，單位為微克(μg);V——試液的初始體積，單位為毫升(mL);V?——測(cè)試時(shí)分取試液的體積，單位為毫升(mL);m——試樣質(zhì)量，單位為克(g);n——稀釋倍數(shù)；值應(yīng)在0.66～1.5,否則需調(diào)整樣液的濃度，調(diào)整稱(chēng)樣量或者稀釋倍數(shù)。測(cè)定結(jié)果用平行測(cè)定的算術(shù)平均值表示，保留三位有效數(shù)字。3.7精密度對(duì)于維生素B?含量低于5mg/kg的飼料，在重復(fù)性條件下，獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果與其算術(shù)平均值的差值不大于這兩個(gè)測(cè)定值算術(shù)平均值的15%;對(duì)于維生素B?含量大于5mg/kg而小于50mg/kg的飼料，在重復(fù)性條件下，獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果與其算術(shù)平均值的差值不大于這兩個(gè)測(cè)定值算術(shù)平均值的10%;對(duì)于維生素B?含量大于50mg/kg的飼料，在重復(fù)性條件下，獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果與其算術(shù)平均值的差值不大于這兩個(gè)測(cè)定值算術(shù)平均值的5%。4方法2:高效液相色譜法4.1原理試樣中核黃素經(jīng)酸性溶液超聲提取后，經(jīng)離心、過(guò)濾后的試樣溶液注入高效液相色譜儀反相色譜系統(tǒng)中進(jìn)行分離，用紫外檢測(cè)器(二極管矩陣檢測(cè)器)或熒光檢測(cè)器檢測(cè)，外標(biāo)法計(jì)算維生素B?的含量。4.2試劑或溶液除特殊說(shuō)明外，所用試劑均為分析純，水為蒸餾水，色譜用水為去離子水，符合GB/T6682中一級(jí)用水規(guī)定。44.2.2庚烷磺酸鈉(PICB?):優(yōu)級(jí)純。4.2.9流動(dòng)相I:在1000mL容量瓶中，稱(chēng)入50mg(精確至0.001g)EDTA(4.2.1)、1.1g(精確至0.001g)庚烷磺酸鈉(4.2.2),加入約700mL去離子水，超聲使固體全部溶解。加入25mL冰乙酸(4.2.4)、5mL三乙胺(4.2.5),用去離子水定容至刻度搖勻。用冰乙酸、三乙胺調(diào)節(jié)該溶液pH至4.2.10.1維生素B?標(biāo)準(zhǔn)貯備液：稱(chēng)取在五氧化二磷干燥器里干燥24h的維生素B?(純度大于95%)素B?濃度為50μg/mL,置于冰箱2℃~8℃保存，可使用6個(gè)月。4.2.10.2維生素B?標(biāo)準(zhǔn)工作液：測(cè)定維生素預(yù)混合飼料樣品，可直接使用維生素B?標(biāo)準(zhǔn)貯備液4.3.3恒溫水浴鍋：0℃~100℃。按GB/T14699.1的規(guī)定采樣，選取有代表性的飼料樣品至少500g,四分法縮減至100g;按(精確至0.001g),于100mL棕色錐形瓶中，加入約70mL的提取液(4.2.7)于100℃水浴中煮沸5GB/T14701—2019上液相色譜儀測(cè)定前所有試液均需經(jīng)0.45μm濾膜(4.3.4)過(guò)濾。4.5.2測(cè)定4.5.2.1高效液相色譜參考條件I色譜柱：C18,長(zhǎng)250mm,內(nèi)徑4.6mm,粒度5μm,或性能相當(dāng)?shù)腃1?柱。柱溫：25℃~28℃。檢測(cè)器：紫外或二極管矩陣檢測(cè)器。4.5.2.2高效液相色譜參考條件Ⅱ色譜柱：C?8,長(zhǎng)250mm,內(nèi)徑4.6mm,粒度5μm,或性能相當(dāng)?shù)腃?g柱。流動(dòng)相：A:磷酸二氫鈉溶液(4.2.8);B:甲醇，梯度淋洗，見(jiàn)表1。柱溫：25℃~28℃。檢測(cè)器：熒光檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)440nm;發(fā)射波長(zhǎng)525nm。表1流動(dòng)相梯度淋洗表時(shí)間/minA:磷酸二氫鈉/%B:甲醇/%0.0099.088.06.5099.099.04.5.2.3定量測(cè)定色譜柱注入維生素B?標(biāo)準(zhǔn)貯備液(4.2.10.1)或者維生素B?標(biāo)準(zhǔn)工作液(4.2.10.2)和試樣溶液(4.5.1),得到色譜峰面積的響應(yīng)值，用外標(biāo)法定量測(cè)定，維生素B?色譜圖參見(jiàn)附錄A。4.6試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理試樣中維生素B?的含量w;以質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示，單位為毫克每千克(mg/kg),按式(2)計(jì)算：式中：A;——試樣溶液峰面積值；V———試樣稀釋體積，單位為毫升(mL);6GB/T14701—2019Ast——標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積平均值；對(duì)于維生素B?含量大于5mg/kg而小于1000mg/kg的飼料，在重復(fù)性條件下，獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果與其算術(shù)平均值的差值不大于這兩個(gè)測(cè)定值算術(shù)平均值的10%;對(duì)于維生素B?含量大于1000mg/kg的飼料，在重復(fù)性條件下，獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果與其算術(shù)平均值的差值不大于這兩個(gè)測(cè)定值算術(shù)平均值的5%。GB/T14701