MS2 介導的口蹄疫類病毒顆粒疫苗的研究-61

1/1MS2介導的口蹄疫類病毒顆粒疫苗的研究MS2介導的口蹄疫類病毒顆粒疫苗的研究董艷美1，張國廣1,2，汪衛(wèi)1，范紅軍3，陳亮*(1廈門大學生命科學學院，福建廈門,361005;2漳州師范學院生命科學與技術系，福建漳州,363000;3河南師范大學生命科學學院，河南新鄉(xiāng),453000)摘要:研究表明口蹄疫病毒（Foot-and-mouthdiseasevirus,FMDV）的VP1蛋白含有關鍵的抗原決定簇。

根據O型HLJOC12/03豬源口蹄疫病毒（FMDV）毒株VP1上第141-160位氨基酸序列設計引物，利用重疊延伸PCR（SOEPCR）技術將該序列插入在大腸桿菌噬菌體MS2外殼蛋白基因的特定位點。

然后連接到原核表達載體pET28a上，構建了重組表達質粒28a-CP-VP1，轉化BL21（DE3），ITPG誘導表達得到融合表達的CP-VP1。

透射電子顯微鏡下觀察融合蛋白CP-VP1成類病毒顆粒（Virus-likeparticles,VLPs）狀。

間接ELISA實驗證實該蛋白能夠特異地結合豚鼠抗O型口蹄疫病毒的陽性血清，30g的CP-VP1類病毒顆粒蛋白免疫小鼠后可以誘導其產生了高效價的特異的抗體。

故該口蹄疫病毒抗原決定簇展示在噬菌體MS2上表面的類病毒顆粒蛋白具有開發(fā)成口蹄疫疫苗的前景。

關鍵詞:口蹄疫；MS2噬菌體；抗原決定簇；類病毒顆粒中圖分類號：

Q78文獻標識碼：

Ａ文章編號口蹄疫（Foot-and-mouthdisease,FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouthdiseasevirus,FMDV）引起的危害牛、豬、羊、駱駝、鹿、牦牛等約70種家畜及野生偶蹄動物的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病[1-5]。

因為其一旦爆發(fā)則傳播速度快,流行范圍廣，補救措施少，可造成上百億美元的直接經濟損失，故被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）列為必須報告的動物傳染病，我國規(guī)定其為一類動物疾病[1,5]。

FMDV為單股正鏈RNA病毒，主要有7個血清型[6,7]，近年來，爆發(fā)流行于我國境內的大都是O型，A型和AsiaI型[5]。

自緬甸98（MYA98）譜系口蹄疫病毒2010年2月在我國廣州白云區(qū)疫區(qū)首次發(fā)現以來，該病毒已經持續(xù)地給我國多省的畜牧業(yè)造成了巨大的損失，并且該病毒在不同宿主變異較大。

雖然傳統的滅活疫苗的免疫原性比較好，也在口蹄疫疫情的控制和在動物保護上發(fā)揮了極其重要的作用,但是，滅活苗在生產過程中不僅要求嚴格，且存在安全隱患的問題[8,9]；并且免疫動物和感染收稿日期：

2012-11-07基金項目：

廈門市科技計劃項目(NO.3502Z20103007)，福建省科技廳重點項目(NO.2009N0051)和福建省自然科學基金(NO.2010J01240)資助作者簡介：

董艷美(1981-)，女，博士研究生．E-mail：

diy1129@163.com.研究方向：

口蹄疫疫苗*通訊作者：

陳亮，男，教授，博導，E-mail：

chenlg@FMDV的動物無法很好區(qū)分，限制了動物產品的出口；此外，滅活苗的有效期較短，諸如此類的缺陷使得尋找更安全穩(wěn)定的新型疫苗成了科學工作者的大方向[3,10-12]。

與傳統疫苗相比，基因工程疫苗是一類非常安全高效的疫苗。

大腸桿菌MS2噬菌體屬于正極性單鏈RNA球形病毒，基因組全長3659bp，編碼成熟酶蛋白（或A蛋白）、外殼蛋白、復制酶蛋白和裂解蛋白等4種蛋白質分子[13,14]。

研究發(fā)現，體外將MS2噬菌體的成熟酶蛋白和外殼蛋白的基因以及包含基因調節(jié)元件的5非編碼序列的基因克隆到表達載體中，誘導表達后的蛋白可自我組裝為成熟的類病毒顆粒[15,16]，且在其外殼蛋白基因的特定位點處插入幾個基因可以表達成外源氨基酸展示的類病毒顆粒狀[17,18]，以此，我們可以開發(fā)出類病毒顆粒疫苗。

類病毒顆粒疫苗作為一種新型的基因工程疫苗，其具有強大的免疫優(yōu)勢：

表面結構規(guī)則，大小合適，易于被免疫系統識別并產生很好的免疫效果；在血清中的半衰期較長等等[19]。

本項研究選擇了O/HLJOC12/03毒株口蹄疫病毒VP1蛋白上關鍵的抗原決定簇第141-160位氨基酸[1,10,20]對應的核苷酸序列，利用SOEPCR插入到MS2噬菌體的外殼蛋白基因的特定位點，經過大腸桿菌誘導表達出O/HLJOC12/03口蹄疫病毒的抗原決定簇多肽表達展示在MS2病毒樣顆粒的表面的類病毒顆粒。

體外和體內的免疫學實驗都證實該類病毒顆粒蛋白可以很好地誘導被免疫的小鼠產生特異的抗體，且具有很好的免疫原性。

本項實驗研究結果為進一步開發(fā)出新型的口蹄疫類病毒顆粒疫苗提供了實驗依據。

1材料與方法1.1材料1.1.1菌株、質粒和主要試劑：

BL21（DE3）表達菌株，為本實驗室保存，質粒pMS27（包含有大腸桿菌噬菌體MS2的結構基因序列）[21]由美國新墨西哥大學的DavidS.Peabody教授惠贈。

限制性內切酶BamHⅠ和NheⅠ酶，氨芐青霉素、卡納霉素等抗生素及Taq酶，T4連接酶，dNTPs和克隆載體pMD18-TSimpleVector等購自TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司；DNAMarker和ProteinMarker購自北京天為時代科技有限公司；DNA凝膠回收試劑盒購自廣州東盛生物科技有限公司；5蛋白緩沖液、SDS配制溶液、磷酸鹽緩沖液和電轉緩沖液等均按分子克隆實驗指南[22]進行配制。

1.1.2實驗動物、陽性血清：

實驗選用的15只20g左右的健康清潔級的BAL（B/C）小鼠購自廈門大學實驗動物中心；O型FMDV抗原和豚鼠的陽性血清等購自中國農科院蘭州獸醫(yī)研究所；辣根過氧化物酶標記的兔抗小鼠的IgG抗體購自成都的杰華科技有限公司。

1.1.3引物：

根據pMS27序列設計的擴增出能夠自我組裝的MS2的5非編碼區(qū)、成熟酶基因、外殼蛋白基因的序列的引物為U-CP和D-CP。

引物序列見表1。

根據網站plexedwithaneutralizingantibody:directinvolvementoftheArg-Gly-Aspmotifintheinteraction.TheEMBOJ,1995,14(8):1690-1696.[26]DiMarchiR,BrookeG,GaleC,etal.Protectionofcattleagainstfoot-and-mouthdiseasebyasyntheticpeptide.Science,1986,232:639-641.[27]MorganD,MooreD.ProtectionofcattleandswineagainstFoot-and-mouthdiseaseusingbiosyntheticpeptidevaccines.AmJVetRes,1990,51:40-45.[28]LiGJ,ChenWZ,YanWY,etal.Comparisonofimmuneresponsesagainstfoot-and-mouthdiseasevirusinducedbyfusionproteinsusingtheswineIgGheavychainconstantregionor-galactosidaseasacarrierofimmunogenicepitopes[J].Virology,2004,328:274-281.[29]ZhangQ,LiLX,YanAG,etal.Immunogenicityofarecombinantfusionproteinoftandemrepeatepitopesoffoot-and-mouthdiseasevirustypeAsia1forguineapigs[J].ActaVirol,2002,46:1-9.[30]SubramanianBM,MadhanmohanM,SriramanR,etal.Developmentoffoot-and-mouthdiseasevirus(FMDV)serotypeOvirus-like-particles(VLPs)vaccineandevaluationofitspotency.ANTIVIRRES,2012,96(3):288-295.StudyonMS2mediatedviruslikeparticlesVaccineagainstFMDV1,GuoguangZhang1,2,WeiWang1,HongjunFan3,LiangYanmeiDongChen*1ThekeyLaboratoryofministryofEducationforCellbiologyandTumorCellEngineering,schoolofLifesciences,XiamenUniversity,Xiamen,Fujian,3610052Departmentofbiologicalscienceandtechnology,ZhangzhouNormalUniversity,Zhangzhou,Fujian,3630003SchoolofLifesciences,HenanNormalUniversity,Henan,Xinxiang,453000Abstract:Foot-and-mouthdisease(FMD)hascausedsevereeconomiclossestomillionsoffarmersinmanycountriesallovertheworld.Theseverityofthediseaseandthespreadofthisepidemicvirushavenotbeencontrolledfruitfully,anditcontinuestobeathreattolivestock.Vaccinationisoneofthemosteffectiveweaponsagainsttheinfectiousdisease.Ourstudywasaimedtodevelopakindofeffectiveandsafeviruslikeparticles(VLPs)vaccine.VP1proteinoffoot-and-mouthdiseasevirus(FMDV)haskeyantigenicdeterminantswhichwereusedbyvaccinedeveloperstimeandagain.Thenucleotidescodingthepeptidesfrom141to160AAofVP1proteinofstrainHLJOC12/03FMDVwereamplifiedandinsertedintothespecificsiteinthecoatproteingeneofMS2byusingSOEPCR.TheproductsweredigestedbyenzymesandthenligatedtothepET28a.Therecombination